雷公藤甲素对感染性休克大鼠脑组织的保护及对TLR4/Myd88信号通路的调控

徐梅 汪砚雨 李晓玲 林新 王勉

1.三门峡市中心医院 河南，三门峡 472000 2.河南科技大学第一附属医院 3.新乡医学院生命科学技术学院

感染性休克（septic shock，SS）是感染后由微生物及其毒素产物导致的脓毒病综合征，可引起多器官功能损伤，甚至导致多器官功能衰竭，是患者主要死因之一[1-2]。脑组织耗氧量大且氧储备量少，因此是SS易累及器官之一，一旦发生脑结构及功能损伤，将直接影响其他器官的休克应答[3]。研究表明，SS合并脑病时将导致预后不良，且急性期患者后仍表现出慢性神经功能障碍[4]。因此，早期保护脑组织功能是降低SS病死率的重要途径之一。雷公藤甲素（triptolide，TL）是卫矛科雷公藤的主要活性成分之一，除具有抗炎、抗生育、免疫抑制、抗肿瘤等药理作用外，其神经功能保护作用逐步受到临床关注。已有动物实验证实，TL能够延缓阿尔茨海默病大鼠模型海马神经元树突棘退化，并具有神经功能保护作用[5-6]。然而，目前关于TL对SS脑组织的保护作用及相关机制的研究尚少。本研究拟通过建立SS大鼠模型，研究TL对其脑组织的保护作用，并探讨相关机制，以期为SS的临床治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD雄性大鼠80只，7周龄，体质量200～240g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号码：SCXK（京）2016-0011]。所有大鼠饲养于新乡华兰生物工程股份有限公司[实验动物使用许可证号码：SYXK（豫）2017-0003]，自由进食及饮水，维持环境相对湿度40%～60%，温度24～26℃，12h/12h昼夜周期照明。

1.2 药物、主要试剂和仪器 TL购于湖北省中医药研究院（纯度＞98%，批号：020122）；地塞米松片购于百正药业股份有限公司（批号：H41022763）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（批号：20060214、20060121）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购于上海江莱生物科技有限公司（批号：JL13202、JL20884）；Nissl染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：C0117）；兔抗鼠Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）多抗、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、 核 转 录 因 子 -κB （nuclear transcription factor-κB，NF-κB）、 磷酸化核转录因子-κB（phospho-nuclear transcription factor-κB，p-NF-κB）单抗均购于美国abcam公司（批号：ab22048、ab119048、ab194726、ab194727）；山羊抗兔IgG二抗购于武汉艾美捷科技有限公司（批号：A21020）。

FPMOUS-ECGenie小动物心电图监测仪购于孚光精仪（中国）有限公司；CX23光学显微镜为日本奥林巴斯株式会社产品；HF4500酶标仪购于北京华安麦科生物技术有限公司；DYC-ZY2转印电泳仪为北京东方瑞利科技有限公司产品；ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统购于美国Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及干预、分组 80只大鼠中随机抽取15只大鼠仅剖腹，不结扎盲肠及穿孔，设为正常组；其余65只建立SS模型，随机分为SS组（16只）、TL低剂量组（16只）、TL高剂量组（16只）和阳性药物组（17只）。SS模型建立采用盲肠结扎穿孔法[7]，大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈动脉置管监测平均动脉压，中下腹部行3cm正中切口，将盲肠自腹腔移出，结扎血管弓内侧末端20%盲肠，20G针穿透结扎线远端阑尾根部两侧肠壁，并挤出少量肠内容物，将内容物涂满腹腔，并保证穿刺孔中持续流出粪便，盲肠还纳后逐层关腹。 TL低、高剂量组建模前1h分别以TL 200、400μg·kg-1灌胃[8]；阳性药物组建模前1h采用地塞米松片溶于0.9%氯化钠溶液中灌胃，根据人、大鼠的体表面积比例换算为等效剂量10mg·kg-1；正常组与SS组均给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，各组均灌胃1次。模型建立成功标准：大鼠平均动脉压降至≤基础值的70%。SS组，TL低、高剂量组建模成功各15只，阳性药物组建模成功15只。

1.3.2 取材方式 建模后12h处死大鼠，剖开头颅，以血管钳清除颅骨，暴露脑组织，5只用于检测脑组织含水量；10只脑组织取出后以预冷的0.9%氯化钠溶液洗涤，去除小脑及枕叶，其中5只用于脑组织SOD活性、MDA、TNF-α、IL-1β含量检测，其余5只分成2份，1份按照《大鼠脑立体定位图谱》[9]中的定位方式切取一侧海马组织，约1mm×1mm×1mm，固定于4%多聚甲醛中用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色及Nissl染色，1份冷冻保存用于Western blot检测。

1.3.3 脑组织含水量检测 采用锡箔纸盛放脑组织，测定重量（湿重），置于烘箱中100℃烤24h至重量不再变化，再次测定重量（干重），计算脑组织含水量。脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3.4 脑组织SOD活性及MDA含量检测 取冷冻保存的脑组织，与磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）混合后匀浆，经黄嘌呤氧化法、硫代巴比妥酸比色法分别检测脑组织SOD活性和MDA含量。

1.3.5 脑组织TNF-α、IL-1β含量检测 取冷冻保存的脑组织，匀浆同1.3.4，获取匀浆组织，根据TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒说明书要求操作。

1.3.6 HE染色观察海马CA1区病理变化 取4%多聚甲醛固定的脑组织，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，4μm切片，烘干，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水冲洗后苏木精染液染色5min，1%盐酸乙醇分化30s；伊红染液染色2min，脱水，透明，晾干，中性树胶封片，光镜下观察海马CA1区病理变化。

1.3.7 Nissl染色观察海马CA1区神经元形态、数量变化 取4%多聚甲醛中固定的脑组织，切片制作同1.3.6，60℃温箱中经1%甲苯胺蓝染液染色40min，蒸馏水充分冲洗，梯度乙醇脱水，透明，封片，光镜下观察。

1.3.8 Western blot法检测脑组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白相对表达量 取冷冻保存的脑组织60mg，研磨后移至离心管，冰上裂解，离心后采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取50μg待测样本，电泳、转膜后封闭2h，加入兔抗大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65单抗 （1∶1 000），4℃摇床孵育过夜，以含吐温的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline and 0.1%Tween-20，TBST）充分洗涤，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室温孵育2h，TBST洗涤，暗室中曝光、显影，以凝胶成像系统扫描、分析，以目的条带灰度值/内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）条带灰度值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多样本资料组间比较采用单因素方差分析，再以最小显著性差异法（least significant difference，LSD）-t进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织含水量比较 各组间总体比较，脑组织含水量差异有统计学意义（P＜0.001）。与正常组比较，SS组，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织含水量均增加（P＜0.05）；与SS组比较，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织含水量均降低（P＜0.05）；与TL低剂量组比较，TL高剂量组和阳性药物组脑组织含水量均降低（P＜0.05）；TL高剂量组和阳性药物组脑组织含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠脑组织含水量比较（±s，%）Tab.1 Comparison of brain tissue water content in each group（±s，%）

表1 各组大鼠脑组织含水量比较（±s，%）Tab.1 Comparison of brain tissue water content in each group（±s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与SS组比较，#P＜0.05；与TL低剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with SS group，#P＜0.05;compared with TL low dose group，△P＜0.05

组别n 脑组织含水量正常组 5 77.82±0.85 SS 组 5 82.01±0.95*TL 低剂量组 5 80.36±0.87*#TL 高剂量组 5 78.97±0.71*#△阳性药物组 5 79.02±0.74*#△F值 18.714 P值 ＜0.001

2.2 各组大鼠脑组织SOD活性和MDA含量比较 各组间总体比较，脑组织SOD活性和MDA含量差异有统计学意义（P＜0.001）。与正常组比较，SS组，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织SOD活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）；与SS组比较，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织SOD活性增加，MDA含量减低（P＜0.05）；与TL低剂量组比较，TL高剂量组和阳性药物组脑组织SOD活性增加，MDA含量降低（P＜0.05）；TL高剂量组和阳性药物组脑组织SOD活性和MDA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表2 各组大鼠脑组织SOD活性和MDA含量比较（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in brain tissues in each group（±s）

表2 各组大鼠脑组织SOD活性和MDA含量比较（±s）Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA content in brain tissues in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与SS组比较，#P＜0.05；与TL低剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with SS group，#P＜0.05;compared with TL low dose group，△P＜0.05

组别 n SOD（U·mg-1） MDA（nmol·mg prot-1）正常组 5 132.74±22.16 1.24±0.30 SS 组 5 82.54±9.73* 4.52±0.57*TL 低剂量组 5 99.02±9.86*# 3.68±0.45*#TL高剂量组阳性药物组F值P值5 5 114.74±11.41*#△117.96±14.52*#△7.970 0.001 2.54±0.32*#△2.37±0.39*#△45.837＜0.001

2.3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β含量比较 各组间总体比较，脑组织TNF-α、IL-1β含量差异有统计学意义（P＜0.001）。 与正常组比较，SS组，TL低、TL高剂量组和阳性药物组脑组织TNF-α、IL-1β含量均增加（P＜0.05）；与SS组比较，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织TNF-α、IL-1β含量降低（P＜0.05）；与TL低剂量组比较，TL高剂量组和阳性药物组脑组织TNF-α、IL-1β含量降低（P＜0.05）；TL高剂量组和阳性药物组脑组织TNF-α、IL-1β含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β含量比较（±s，pg·mg-1）Tab.3 Comparison of TNF-α and IL-1β contents in brain tissues in each group（±s，pg·mg-1）

表3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β含量比较（±s，pg·mg-1）Tab.3 Comparison of TNF-α and IL-1β contents in brain tissues in each group（±s，pg·mg-1）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与SS组比较，#P＜0.05；与TL低剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with SS group，#P＜0.05;compared with TL low dose group，△P＜0.05

组别 n TNF-α IL-1β正常组 5 2.78±0.34 0.14±0.03 SS 组 5 4.91±0.52* 0.37±0.04*TL 低剂量组 5 4.16±0.50*# 0.28±0.03*#TL高剂量组阳性药物组F值P值5 5 3.47±0.41*#△3.42±0.43*#△16.695＜0.001 0.20±0.02*#△0.19±0.03*#△43.245＜0.001

2.4 各组大鼠海马CA1区病理变化比较 HE染色结果显示，正常组海马CA1区细胞形态完好、排列整齐、边界清晰，无核固缩，细胞核为蓝色；SS组细胞体积缩小、数量减少、排列紊乱、突起结构模糊或消失，多数细胞发生空泡样改变及死亡，表现为核破裂、核固缩；TL低、高剂量组和阳性药物组多数细胞边界清晰，排列较为整齐，少数细胞发生萎缩、深染、空泡变性。见图1。

图1 各组大鼠海马CA1区病理变化（HE染色，200×）Fig.1 Pathological changes of hippocampal CA1 area in each group（HE staining，200×）

2.5 各组大鼠海马CA1区神经元形态数量比较 Nissl染色结果显示，正常组海马CA1区细胞形态正常，边缘明显，染色清晰，排列紧密，细胞核大且圆，核仁明显，胞质中尼氏体数量丰富；SS组细胞排列稀疏，边缘模糊，染色浅，神经元数目减少，且发生核固缩、胞质深染，胞质中尼氏体数量明显减少；TL低、高剂量组和阳性药物组神经元数量增加，染色较清晰，胞质中尼氏体数量较SS组增加。见图2。

图2 各组大鼠海马CA1区神经元形态数量变化（Nissl染色，400×）Fig.2 Neutron morphology and quanting changes of hippocampal CA1 area in each group（Nissl staining，400×）

2.6 各组大鼠脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量p-NF-κB p65/NF-κB p65比较 各组间总体比较，脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65差异有统计学意义（P＜0.001）。 与正常组比较，SS组，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）；与SS组比较，TL低、高剂量组和阳性药物组脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低（P＜0.05）；与TL低剂量组比较，TL高剂量组和阳性药物组脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低（P＜0.05）；TL高剂量组和阳性药物组脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图3。

表4 各组大鼠脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65比较（±s）Tab.4 Comparison of the relative expression of TLR4 and MyD88 proteins，p-NF-κB p65/NF-κB p65 in brain tissues in each group（±s）

表4 各组大鼠脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65比较（±s）Tab.4 Comparison of the relative expression of TLR4 and MyD88 proteins，p-NF-κB p65/NF-κB p65 in brain tissues in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与SS组比较，#P＜0.05；与TL低剂量组比较，△P＜0.05Note:Compared with normal group，*P＜0.05;compared with SS group，#P＜0.05;compared with TL low dose group，△P＜0.05

组别 n TLR4 MyD88 p-NF-κB p65/NF-κB p65正常组 5 0.09±0.01 0.18±0.03 0.11±0.02 SS 组 5 0.59±0.06* 0.98±0.09* 0.38±0.04*TL 低剂量组 5 0.43±0.05*# 0.51±0.06*# 0.29±0.03*#TL 高剂量组 5 0.25±0.04*#△ 0.28±0.04*#△ 0.20±0.03*#△阳性药物组 5 0.23±0.03*#△ 0.25±0.03*#△ 0.18±0.02*#△F值 108.391 176.242 65.298 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图3 各组大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白相对表达量Fig.3 The relative expression of TLR4，MyD88，p-NF-κB p65，NF-κB p65 protein in each group

3 讨论

微循环障碍是SS进程中重要的病理生理基础，由于微循环障碍导致脑组织缺血、缺氧，通过连锁反应分泌大量氧自由基，造成脂质过氧化，由于神经细胞膜上多价不饱和脂肪酸含量丰富，极易发生氧化应激损伤，细胞内细胞器如线粒体作为氧化应激靶标容易受到氧自由基攻击，最终引发海马区锥体细胞死亡[10]。SS后脑损伤以精神状态改变、谵妄、昏迷等为主要表现，部分表现为神经电生理及脑部影像学异常，可能与氧化应激导致的炎症反应、脑水肿、血脑屏障损伤及神经元功能损伤有关[11-12]。尽管西药治疗可在一定程度上保护SS后脑损伤，但可能出现较为严重的副作用，安全性有待提升，因此相对安全的中药治疗具有广阔的应用前景。

氧自由基大量释放、氧化应激反应激活是SS后脑组织损伤的重要病理环节，并通过与炎症介质的连锁反应参与SS发生、发展[13]。研究显示，SS后机体TNF-α、IL-1β等炎症介质呈“瀑布样”释放，诱导组织及器官损伤[14]。本研究中，SS组，TL低、高剂量组脑组织含水量，MDA、TNF-α、IL-1β含量依次降低，SOD活性依次升高，病理变化依次减轻，神经元数量及胞质中尼氏体数量依次增加，提示TL可减轻脑组织水肿、氧化应激、炎症反应及病理变化，保护神经元功能。地塞米松作为肾上腺皮质激素类药物，是治疗SS的常用药物，本研究采用其作为阳性对照药物，结果显示TL与地塞米松整体疗效相当，进一步说明TL应用于SS治疗效果满意。TL是中药雷公藤中活性最强的环氧化二萜内酯化合物，关于其脑组织损伤保护作用，目前通常从以下几方面进行阐述：抑制炎症反应及小胶质细胞的活化；减少细胞中钙累积，减轻氧化应激反应；抑制神经元凋亡，从而减轻脑组织损伤[15]。Zhu等[16]采用TL治疗脊髓损伤时发现，HE染色及Nissl染色结果显示神经细胞死亡数量明显减少，且机体运动功能明显改善，证实了TL在神经系统疾病治疗中的潜力。于胜国等[17]研究显示，TL具有脑损伤保护作用，可有效减轻脂多糖诱导的大鼠脑组织氧化应激反应，抑制神经细胞凋亡。本研究结果与其相似，再次证实了TL的脑损伤保护作用。

TLR是重要的先天性免疫模式识别受体，在天然免疫中有较高的参与度，对病原相关分子模式具有特异性识别作用，也是固有免疫与天然免疫的连接桥梁[18]。TLR4主要通过MyD88依赖、非依赖两种途径进行信号转导，MyD88位于TLR4下游，包含N端死亡区、Toll区、与转位紧密黏附素受体（translocated intimin receptor，TIR）结合的C末端3个功能区域，其中N端死亡区通过结合白介素-1R（interleukin-1R，IL-1R）相关激酶的死亡结构域，导致其磷酸化，诱导NF-κB激活及转位，激活TNF-α、IL-1β等炎症介质释放，最终导致机体的炎症反应[19]。吕鹏等[20]采用槲皮素干预SS大鼠时发现，槲皮素能够抑制肺组织TLR4信号通路相关蛋白表达，从而减轻肺损伤，提示TLR4信号通路在SS发生、发展中的作用。王华柱等[21]研究发现，使用脂多糖建立脓毒性休克大鼠模型后1、6、24h，TLR4蛋白表达及脑细胞凋亡数量呈增加趋势，且各个时间段均高于健康大鼠，表明TLR4在SS大鼠脑组织中呈异常高表达，且与重要脏器组织的细胞凋亡有关。本研究结果显示，SS组，TL低、高剂量组脑组织TLR4、MyD88蛋白相对表达量，p-NF-κB p65/NF-κB p65依次降低，提示TL对SS脑组织的保护作用可能与抑制TLR4/MyD88信号通路有关。

综上所述，本研究证实TL可减轻SS大鼠脑组织水肿，抑制氧化应激及炎症反应，减轻脑组织病理变化，保护神经元，其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88信号通路相关蛋白表达有关。