脐带间充质干细胞治疗乳腺癌核心靶点的预测

尤斯涵 郭春燕

河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

乳腺癌（breast cancer，BC）是指发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，其病因复杂，易受环境和遗传因素的影响［1］。尽管目前有了很多治疗BC 的方法，比如放射治疗和手术、激素阻断剂的给药、化学疗法和单克隆抗体，但是仍有许多患者在治疗后出现乳腺癌复发等不良结果［2］。脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一种存在于新生儿脐带组织中的多功能干细胞［3］。UC-MSCs 具有易于获得、扩增等多个优点［4］；由于UC-MSCs 的表面抗原不突出，对移植细胞的免疫排斥反应不明显，配型要求不严格，便于移植［5-6］。至今，已有多项试验评估了UC-MSCs 治疗恶性肿瘤（malignant tumor）的疗效，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［7-8］。

网络药理学旨在研究靶点、药物、疾病和通路之间复杂多变的关系，为药物发现提供了一种新方法［9］。目前，生物信息学已成为通过处理大量原始数据来研究系统特性的新工具。因此，网络药理学和生物信息学的方法不仅帮助我们获取治疗疾病的差异基因，还能给出与疾病相关的生物学通路等信息。基于此种背景，本研究将通过采用GEO 数据库利用网络药理学和生物信息学的方法对所选临床实验数据进行分析，研究UC-MSCs 治疗BC 的核心靶点及差异基因，初步探索它们的作用与功能，希望能为治疗BC 提供新的方向。

1 UC-MSCs 治疗BC 的材料与方法

1.1 材料

进入NCBI（www.ncbi.com.cn）选择GEO 数据库以“Human umbilical cord”、“Homo sapiens”为关键词进行检索，得到了Naomi Ohta 等［10］提供的芯片数据GSE64827，下载UC-MSCs 细胞治疗的原始数据。

1.2 方法

1.2.1 差异基因的获取

通过检索Pubmed、Embase、Cochrane Library 和Web of Science 数据库，搜索UC-MSCs 抑制和促进肿瘤的文献。进入 NCBI（www.ncbi.com.cn）的首页界面，选择 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term=）进行搜索。依据参考文献与病例信息，利用数据库预置芯片数据，下载UC-MSCs 细胞治疗的原始数据。

通过使用R 软件对所得的原始数据进行R 算法的原始数据处理分析（四分位数数据进行归一化处理）。即将数据中的探针ID 转换为基因名，通过R 软件进行跑图，得到UC-MSCs 细胞治疗前后的差异基因，并将所得的结果以火山图的形式展现出来。

1.2.2 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析

从STRING 数据库［11］中找出这些差异基因的相关基因并进行整理，从中选取置信度值在0.7 以上（包含0.7）的差异基因及相关基因。利用Cytoscape3.2.1软件进行渲染作图分析，做出筛选差异基因及其相关基因的相互作用关系。运用Cytoscape3.2.1 软件中“Network Analyzer”得出平均自由度以及最大自由度值，对筛选的差异基因及其相关基因相互作用进行拓扑筛选得到其PPI 网络图。

1.2.3 GO 和KEGG 分析

利用生信分析检索引擎DAVID［12］（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）和R 软件对实验数据中的差异基因进行GO 富集分析和KEGG 通路分析。

2 结果

2.1 获得的差异基因

Naomi Ohta 等提供的芯片数据GSE64827 中一共含有6 个样本，其中有3 例是UC-MSCs 的对照样本，剩余的3 例是UC-MSCs 与乳腺癌细胞（MDA-231 细胞）共培养的样本。利用R 软件进行数据信息标准化处理（Fig.1），通过分析得到了11 个上调的差异基因（Tab.1），并绘制出火山图（Fig.2）。

Fig.2 Volcano plot of differential genes

Tab.1 Differential genes

Fig.1 Data GSE64827 sample normalization correction

2.2 PPI 网络分析结果

在基因蛋白-基因蛋白相互作用中，选取置信度大于等于 0.7 的基因并通过Cytoscape3.2.1 软件对11 个差异基因及其相关基因的相互作用关系作图（Fig.3），得到与10 个差异基因相互作用的基因有68 个，通过274条边进行相互作用。在Cytoscape3.2.1 软件“Network Analyzer”得出平均自由度7.026 以及最大自由度19，对Fig.3 进行拓扑筛选得到其PPI 网络图（Fig.4），得出42 个节点基因，并通过179 条边进行相互作用，其中颜色由红到黄代表重要程度依次降低。经拓扑筛选出PPI 网络中关联度高（基因间相互作用多）的差异基因（Tab.2）。

Tab.2 Four differential genes with high correlation in the post-topology PPI network

Fig.3 Interaction relationship between 11 differential genes and their related genes

Fig.4 10 differential genes and their related genes PPI network（topology）

2.3 GO 功能富集结果

通过DAVID 在线分析工具和R 软件得出GO 功能的富集分析结果（Fig.5），其中GO 分析注释得到了3 条生物过程，分别是果糖代谢过程、糖酵解过程和缺氧反应过程。GO 分析涉及的主要基因为PFKFB4、ALDOC、DDIT4、CA9。

Fig.5 GO enrichment analysis

2.4 KEGG 通路分析结果

利用DAVID 在线分析工具和R 语言软件得出KEGG 通路图（Fig.6），从Fig.6B 中可以看出，红色区域（3.1.3.46 和4.1.2.13）可能含有11 个差异基因。进KEGG 数据库查询得出3.1.3.46 中含有差异基因醛缩酶C（aldolase fructose-bisphosphate C，ALDOC），4.1.2.13 中含有差异基因PFKFB4。对11 个差异基因进行R 分析，将得出的KEGG 通路结果数据做气泡图（Fig.7）。从Fig.7 中可以看出其只出现了一条通路，即果糖和甘露糖代谢。

Fig.6 KEGG pathway analysis

Fig.7 The bubble chart of KEGG pathway

3 讨论

网络药理学能够通过大数据集来分析预测活性生物物质的可能机制，从而确定药物在癌症等疾病治疗中的效应。生物信息学是生物研究的最新领域之一，主要通过使用数学、统计和计算等方法来处理和分析生物数据。因此本文利用这两种方法来研究UC-MSCs治疗BC 的核心靶点及差异基因。

本文通过利用R 软件对NCBI（www.ncbi.com.cn）中的GEO 数据库搜索UC-MSCs 治疗BC 的原始数据集GSE64827 进行处理，筛出得出11 个差异基因，即PFKFB4、ALDOC、DNA 损伤诱导转录转录物4（DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4）、碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9,CA9）、胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGF-binding proteins 3,IGFBP3）、跨膜蛋白45A（transmembrane protein 45A,TMEM45A）、锌指蛋白395（zink finger 395,ZNF395）、重组人胞内氯离子通道蛋 白3（chloride intracellular channel protein 3,CLIC3）、NDUFA4L2、MGC23985、ANKRD37。

PFKFB4 在癌细胞糖酵解的调节及其增殖和存活中起重要作用［13］。目前，PFKFB4 已被确定为多种癌症的关键分子［14］。研究表明［15］，PFKFB4 通过以p38信号通路诱导透明质酸合酶2 (hyaluronan synthase 2，HAS2)表达和产生透明质酸来促进乳腺癌细胞的转移。因此，PFKFB4 基因涉及的相关通路可能是UCMSCs 治疗BC 发挥疗效的机制之一。醛糖酶家族是参与糖酵解过程的主要酶之一。ALDOC 属于醛缩酶家族，存在于正常脑组织中，负责修复受损组织［16］。由于PFKFB4 参与癌细胞糖酵解的调节及其增殖和存活，因此推断ALDOC 蛋白可能参与BC 糖酵解的调节。由DDIT4 编码的蛋白质的主要功能是在压力条件下抑制mTOR［17］。有研究表明［18］，mTOR 信号传导在癌症及肿瘤微环境中具有重要作用。因此，初步推断DDIT4 可能是治疗BC 的潜在选择。CA9 是一种肿瘤相关酶［19］，在一些恶性肿瘤中过度表达［20］。

IGFBP3 是一种 p53 肿瘤抑制调节蛋白［21］。有研究发现，TMEM45A 与肿瘤进展和侵袭有关［22］。在缺氧条件下，ZNF395 水平升高可能通过激活先天免疫反应和癌症的靶基因来参与炎症和癌症进展［23］。CLIC3 是一种存在于细胞内的氯离子通道，其与肿瘤细胞的凋亡和迁移密切相关［24］。NDUFA4L2在TRHER2 阳性乳腺癌细胞系中高度表达［25］；MGC23985 等基因虽未找到相关报道，但从功能上看其与肿瘤有着密切的联系。总之，这11 个差异基因也许可以成为BC 的治疗突破口，为治疗BC 提供新的方向。

PPI 网络是了解细胞功能、疾病机制和药物设计或其重新定位的可行工具［26］。在PPI 网络中，一般选用节点的自由度值大小来表征节点基因的重要程度，即自由度值越大，节点基因越重要。一般对基因进行GO富集分析，能够找出差异基因与哪些生物功能的改变相关。KEGG 数据库［27］（http：//www.kegg.jp/）主要用于进一步了解生物学高级功能和生物体系，并从分子水平角度进行基因的富集分析，找寻其中可能参与疾病发生和发展的信号通路。因此，本文通过STRING数据库的拓扑后的PPI 网络得到了ALDOC、IGFBP3、DDIT4 和PFKFB4 这4 个关联度较高的基因。通过GO 分析，得出涉及的主要基因为PFKFB4、ALDOC、DDIT4 和CA9。通过KEGG 通路分析，得出涉及基因为ALDOC，PFKFB4。

综上，通过利用网络药理学和生物信息学技术平台可以初步预测出UC-MSCs 治疗乳腺癌核心靶点有ALDOC、PFKFB4 和DDIT4。这些基因靶点为UCMSCs 治疗BC 提供了新的作用机制思路。猜测UCMSCs 抑制BC 可能与糖代谢通路有关。未来采用UC-MSCs 调节相关基因表达来参与抑制乳腺癌的发生是非常可能的。但是，由于上述临床数据样本量小，缺乏大数据、大样本的多中心随机对照的试验进行的临床研究，且有关UC-MSCs 的治疗BC 疾病的机制仍尚未完全阐明，因此需要更加深入地系统研究其治疗的可能性机制，以确保UC-MSCs 能更好地应用于BC的临床治疗中。