平地木化学成分及含量分析

张冠腾 庞策 左亚奇 甄攀

河北北方学院，张家口，075000，中国

平地木（Ardisia japonica（Thunb）Blume）为灌木植物，多见于海拔约1 200 米以下的山间林下较荫湿的地方。平地木的药用价值很高［1-3］，具有止咳平喘、清利湿热、活血化瘀、通经止痛［4-6］的功效。据文献［7］报道，平地木中的一些化学成分对艾滋病、呼吸道合胞病毒等有很好的治疗效果；除此之外，平地木中三萜类皂苷成分能降低一些蛋白的表达，对肝细胞产生一定的影响［8］。

利用层析法对平地木的乙醇提取物进行分离、纯制，所得单体化合物用质谱（mass spectrometry，MS）、红外图谱（infrared spectroscopy，IR）、核磁共振谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）等方法解析其分子结构。本实验从平地木中发现四种化合物，化合物1 为新成分，化合物3 和4 系首次从平地木中发现。以自制的化合物2 为对照品，建立了高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定其含量的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药材

平地木：采自湖南省永州市都庞岭，由河北北方学院基础医学院魏会平教授鉴定为Ardisia japonica（Thunb）Blume。

1.1.2 仪器和试剂

BRUKER AV500-III 核磁共振仪，德国Bruker 公司（德国）；BiflexIII-TOF 质谱仪，美国布鲁克道尔顿公司（美国）；FT-IR-650 型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技发展股份有限公司（中国）；Agilent 1100 高效液相色谱仪，Agilent 公司（美国）；Agilent 1200 制备型高效液相色谱仪，Agilent 公司（美国）；紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司（中国）；硅胶GF254 薄层板、柱色谱硅胶（100～200 目），青岛海洋化工厂（中 国）；YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色谱柱，YMC 公司（日本）；WondaSil C18 Superb 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），上海实验器材有限公司（中国）；甲醇、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷、石油醚，天津津东天正有限公司（中国）；水为娃哈哈纯净水。

1.2 实验方法

1.2.1 化学成分分离鉴定

平地木全株5.5 kg，粉碎，用无水乙醇浸泡24 h，重复提取2 次，提取液合并，过滤，滤液旋蒸，得膏状物610 g。膏状物继续用100～200 目硅胶柱进行分离纯化，洗脱剂分别为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，各洗脱液分别收集，旋蒸，得到黑棕色固体，分别为10.34 g、46.04 g 和42.56 g。

将二氯甲烷洗脱部分用D101 大孔树脂进一步分离纯化，洗脱剂为不同比例的乙醇-水（30%、50%、70%、80%、90%和100%），洗脱液分别收集，旋蒸，得固体物，质量分别为0.41 g、3.50 g、7.14 g、9.58 g、5.29 g、8.40 g。

将上述三、四和六部分进一步纯化，用C18柱色谱分离纯化，洗脱剂为不同比例的甲醇-水（50%、70%、80%、90%、100%），用试管每5 mL 收集一管，薄层色谱鉴别，相同成分合并，旋蒸，得多种固体物。

上述得到各部分固体物用甲醇溶解，甲醇-水为流动相，用Agilent 1200 制备型高效液相色谱仪纯制，得到单体化合物。单体化合物通过MS、UV、IR、NMR 等谱图解析其分子结构。

化合物1 制备色谱条件：Agilent 制备型高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色谱柱，YMC 公司（日本）；流动相：甲醇-水（84∶16），流速：1 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：210 nm；柱温：20 ℃。

化合物2 制备色谱条件：Agilent 制备型高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色谱柱，YMC 公司（日本）；流动相：甲醇-水（94∶6），流速：1 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：210 nm；柱温：20 ℃。

化合物3 制备色谱条件：Agilent 制备型高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色谱柱，YMC 公司（日本）；流动相：甲醇-水（80∶20），流速：1 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：210 nm；柱温：20 ℃。

化合物4 制备色谱条件：Agilent 制备型高效液相色谱仪；色谱柱：YMC C18（250 mm×20 mm，5 μm）色谱柱，YMC 公司（日本）；流动相：甲醇-水（80∶20），流速：1 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：210 nm；柱温：20 ℃。

1.2.2 平地木中化合物2 的含量测定

1.2.2.1 色谱条件 Waters 高效液相色谱仪（美国Waters e2695）；色谱柱：WondaSil C18Superb（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（75∶25），流速：1 mL·min-1；紫外检测器，检测波长：254 nm；柱温：25 ℃。

1.2.2.2 标准曲线 吸取上述得到的化合物2 少量，用甲醇稀释，配制成有浓度梯度的标准系列，按照1.2.2.1中色谱条件依次测定，以对照品的峰面积与质量浓度（mg·mL-1）进行回归分析，回归方程为y=17 009x-318.08（r=0.999 7），线性范围0.054～ 0.870 mg·mL-1。

1.2.3 方法学考察

实验测得精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.58%，24 h 内稳定性的RSD为0.30%，加标回收率为102.6%。

1.2.4 含量测定

将未处理过的干燥平地木的根、茎、叶分别粉碎，收集各部分的粉末，分别称量一定量的粉末，加入一定量的石油醚，浸泡一段时间，进行回流提取，每次一小时，一共提取两次，收集得到的滤液，过滤，用甲醇定容至25.00 mL。按照1.2.2.1 中色谱条件依次测定。

2 实验结果

2.1 分子结构解析

化合物1，白色无定形固体，HR-ESI-MS m/z：331.263 7 ［M-H］-（计算值为331.497 9，C22H35O2），结合NMR 推测其分子式为C22H36O2，不饱和度为5，紫外光谱（ultraviolet and visible spectrum，UV）显示在254 nm 处有吸收，IR 在1 585、1 520 cm-1有峰存在，证明结构中含有苯环；在3 409 cm-1有一个宽峰，证明含有酚羟基；在2 850、2 923 cm-1附近有两个峰，证明结构中含有甲基和亚甲基；在1 635 cm-1有一个峰，证明结构中含有烯烃；在723 cm-1附近有小峰存在，证明结构中含有4 个以上的直链烷烃。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）（Tab.1）中显示了两个芳香氢信号δH6.22（2H，s，4-H，6-H），两个烯氢信号δH5.38（2H，m，10′-H和11′-H），高场区显示有两个甲基信号δH2.12（3H，s，2-CH3），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，15′-H），根据化学位移可以判断δH2.12 为一个烯甲基信号，1.25～1.40 之间有堆集的脂肪氢信号，提示该化合物可能有不饱和脂肪链结构片段。该化合物的13C NMR（Tab.1）显示四个芳香碳原子信号δ 154.46（1-C，3-C），142.03（5-C），107.95（4-C，6-C），107.62（2-C），提示该化合物存在对称结构。此外，还有两个烯碳信号δ129.95（10′-C），129.92（11′-C），两个甲 基信号13.98（15-C），7.76（2-CH3）。以上数据和文献［9］报道的Ardisinol I 比较接近，经核磁数据比较，两个化合物的结构差别仅在于侧链的不同，该化合物的侧链只有一个双键。在HMBC 谱中，末端甲基信号和一个烯氢信号（11′-H）均和13′-C 有HMBC 远程相关，提示双键处于10′-C 和11′-C。根据两个烯氢的偶合常数，推断双键的构型为顺式构型。根据以上信息，化合物1 的结构式鉴定为2-甲基-5-［10′（顺）-十五烯基］-间苯二酚，经文献检索，确认为一未报道过的新化合物。化合物1 的1H NMR和13C NMR 数据见表1，化合物1 的结构式见Fig.1。

Fig.1 Chemical structure of compound 1

Tab.1 1H NMR and 13C NMR of compound 1

化合物2，白色无定形固体，HR-ESI-MS m/z：303.232 5 ［M-H］-（计算值为303.446 1，C20H31O2），结合NMR 推测其分子式为C20H32O2。化合物2 的核磁数据和化合物1 比较相似，1H NMR（500 MHz，CDCl3）中显示了两个芳香氢信号δH6.22（2H，s，4-H 和6-H），两个烯氢信号δH5.35（2H，m，8′-H 和9′-H），高场区显示有两个甲基信号δH2.09（3H，s，2-CH3），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H），1.28～1.32 之间有堆集的脂肪氢信号，提示该化合物可能含有不饱和脂肪链结构片段。化合物2 的13C NMR 谱仅在δ29.0 附近的个数碳原子个数和化合物1 有明显区别，结合两个化合物的高分辨数据和核磁数据，化合物2 的不饱和脂肪链碳原子个数为13，末端甲基信号和一个烯氢信号9′-H 均和11′-C 有HMBC 远程相关，提示双键位于8′-C 和9′-C。综上所述，化合物2 的1H NMR 和13C NMR 的数值与文献［10］报道的化合物Ⅰ基本一致，因此，化合物2 为2-甲基-5-［8′（顺）-十三烯基］-间苯二酚。

苯环结构的归属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.22（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.57（1-C，3-C），142.06（5-C），108.85（4-C，6-C），107.83（2-C）。

取代基 的归属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.22（2H，s，4-H，6-H），5.35（2H，m，8′-H 和9′-H），2.42（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.09（3H，s，2-CH3），2.01（4H，m，7′-H 和10′-H），1.53（2H，m，2′-H），1.28～1.32（16H，m，3′-H～6′-H，11′-H，12′-H），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H），。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 130.05（1-C），130.00（5-C），35.62（1′-C），32.06（11′-C），31.2（2′-C），27.30（7′-C），27.02（8′-C），22.43（12′-C），14.07（13′-C），7.88（2-CH3）。

化合物3，白色无定形固体，HR-ESI-MS m/z：305.248 4 ［M-H］-（计算值为305.462 0，C20H33O2），结合NMR 推测其分子式为C20H34O2。化合物3 的核磁数据和化合物1 和2 均比较相似，该化合物的1H NMR（500 MHz，CDCl3）缺失了两个烯氢的质子信号，13C NMR 谱缺失了两个烯碳信号，提示该化合物5 位的取代基为饱和脂肪链，结合该化合物的高分辨质谱数据和核磁数据，脂肪链碳原子个数为13。综上所述，化合物3 的1H NMR 和13C NMR 的数值与文献［11］报道的化合物1 基本一致，因此，化合物3 的结构鉴定为2-甲基-5-十三烷基间苯二酚。

苯环结构的归属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.23（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.66（1-C，3-C），142.23（5-C），108.00（4-C，6-C），108.00（2-C）。

取代基 的归属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：2.45（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.10（3H，s，2-CH3），1.53（2H，m，2′-H），1.25～1.29（24H，m，3′-H～12′-H），0.89（3H，t，J=7.0 Hz，13′-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 35.67（1′-C），32.07（11′-C），31.33（2′-C），22.83（12′-C），14.24（13′-C），7.83（2-CH3）。

化合物4，白色无定形固体，HR-ESI-MS m/z：333.279 0 ［M-H］-（计算值为333.513 8，C22H37O2），结合NMR 推测其分子式为C22H38O2。化合物4 的核磁数据和化合物3 比较一致，该化合物的1H NMR（500 MHz，CDCl3）中未发现烯氢的质子信号，13C NMR 谱中未发现烯碳信号，说明该化合物5 位的取代基同样为饱和脂肪链，结合该化合物的高分辨质谱数据和核磁数据，脂肪链碳原子个数为15。综上所述，化合物4 的1H NMR 和13C NMR 的数值与文献［12］报道的化合物2 基本一致，因此，化合物4 的结构鉴定为2-甲基-5-十五烷基间苯二酚。

苯环结构的归属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.23（2H，s，4-H，6-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 154.66（1-C，3-C），142.23（5-C），108.00（4-C，6-C），108.00（2-C）。

取 代基的归 属：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：2.45（2H，t，J=7.5 Hz，1′-H），2.10（3H，s，2-CH3），1.55（2H，m，2′-H），1.25～1.29（24H，m，3′-H～14′-H），0.88（3H，t，J=7.0 Hz，15′-H）。13C NMR（500 MHz，CDCl3）：δ 35.67（1′-C），32.08（13′-C），31.32（2′-C），22.84（14′-C），14.25（13′-C），7.83（2-CH3）。

2.2 化合物2 的含量

平地木根、茎、叶中化合物2的含量分别为16.79 mg·g-1、19.39 mg·g-1和24.59 mg·g-1，重复测定5 次，RSD分别为0.21%、0.76%和1.7%。化合物2 对照品色谱图见Fig.2A，平地木乙醚提取液色谱图见Fig.2B。

3 讨论

利用硅胶、D101 大孔吸附树脂和C18 等方法分离，用高效液相色谱仪纯化，得到四种单体化合物。分别为2-甲基-5-［10′（顺）-十五烯基］ -间苯二酚，2-甲基-5-［8′（顺）-十三烯基］-间苯二酚，2-甲基-5-十三烷基间苯二酚，2-甲基-5-十五烷基间苯二酚。化合物1 为新化合物，化合物3 和4 为首次从本植物中发现。

以自制的化合物2 为对照品，HPLC 法测定其含量。对比石油醚和乙醇提取物，石油醚提取物的色谱图（Fig.2B）几乎没有杂峰，干扰因素较少，分离效果较好；乙醇提取物的色谱图峰多杂乱，分离效果较差；实验证明，石油醚提取效率高于乙醇。因此，本文用石油醚为溶剂提取化合物2。

Fig.2 Chromatogram of Ardisia japonica （Thunb） Blume

据文献报道［13］，化合物2 的UV λmax为275 nm，但本文选择了254 nm 作为检测波长，因为天然药物中的许多成分均在254 nm 有吸收，且本文中的四个化合物在254 nm 都有吸收。因此，为了最大程度体现其他成分对化合物2 定量分析的干扰，选择了254 nm 作为检测波长。