利用SPME-GC-MS 分析评价海鱼脂肪氧化程度的方法研究

田迪英，毕丽君，董丽娟，张鸿发

(浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018)

海鱼富含二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等不饱和脂肪酸，海鱼在加工和贮藏过程中，不饱和脂肪酸易被氧化而产生不良的气味，是海鱼品质恶化的主要因素，也是鱼类产品货架期的决定性因素[1-7]。因此，测定分析海鱼的脂肪氧化程度，对确保海鱼制品的品质具有重要意义。

目前测定脂肪氧化大多采用过氧化值（PV）法和硫代巴比妥酸试验（TBA）法[8-9]，分别是以氢过氧化物和醛含量为指标，但这两种方法均忽略了脂肪氧化产生的小分子挥发性化合物醇、酮、酸等物质[5-6]。现已证实1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛等小分子挥发性物质与肉类制品脂肪氧化程度密切相关[10]，而对于此类挥发性物质与海鱼脂肪氧化程度的相关性研究鲜有报道。基于此，本文以浙江省内常见海鱼（黄鱼、鳗鱼、鳕鱼、鲳鱼和马鲛鱼）为原料制成鱼片，采用Schaal 烘箱加速氧化法进行加速氧化试验[11-13]，利用SPMEGC-MS 技术分析挥发性物质含量的变化，与感官评定[14]、TBA 值测定[15]进行比较，以建立评价脂肪氧化程度的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

浙江市场常见海鱼：鲳鱼、黄鱼、鳗鱼、鳕鱼、马鲛，购于杭州华商超市。

试剂：己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、甲醇（色谱纯，上海宝曼生物科技有限公司）；3-辛醇（色谱纯，购于Sigma 公司）；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、氯仿、TBA（分析纯）。

1.1.2 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪（Thermo 公司），SPME（65 μm DVB/CAR/ PDMS）（Supelco 公司），GG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司），DHP-9052 电热恒温培养箱（上海申贤恒温设备厂），Thermo sorvall RC-6 Plus 冷冻离心机（瑞士）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理、色谱、质谱测定条件[6]

冰鲜海鱼清洗后切得鱼肉，沸水中煮5 min后，取2.5 g 样品置于15 mL 顶空样品瓶中，将样品瓶放于60 ℃恒温预处理室预热10 min，将萃取头插入密封的萃取瓶内，顶空萃取20 min 后插入气相色谱进样口热解吸5 min，进行气质分析。

色谱条件：ThermoTR-WaxMS 柱（30m×0.25mm×0.25 μm），载气为氦气，载气流速为0.8 mL/min，不分流。进样口温度为230 ℃。升温程序：起始温度为40 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min 的速率上升至90 ℃，再以4 ℃/min 上升到160 ℃，保持1 min，最后以8 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：电离方式为电子轰击（EI 源），电子能量为70 eV；灯丝发射电流为200 μA；传输杆温度为250 ℃，离子源温度为200 ℃，检测器电压为350 V；质量扫描速率为5 scans/sec，扫描范围为33～350 m/z。

1.2.2 顶空固相微萃取条件

向15 mL 样品瓶中加入2 g 样品、4 mL 纯水及内标物3-辛醇，在(60±0.1) ℃下水浴10 min，顶空萃取20 min，插入气相色谱进样口热解吸5 min后进行SPME-GC-MS 分析。

1.2.3 定性定量方法[16]

归一法：挥发性成分通过与NISTDEMO、MAINLIB、REPLIB 标准谱库数据进行比对，且仅对正反相似度均大于800（最大值为1000）的鉴定结果才予以报道。按峰面积归一化计算各挥发性成分在鱼肉气味物质中的相对百分含量。

内标法：配制1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛系列标准溶液及内标溶液（3-辛醇）后进行GCMS 测试分析。以外内标浓度比为横坐标、外内标面积比为纵坐标做标准曲线，通过标准曲线计算试样中1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛的含量。

1.2.4 试样的加速氧化试验

采用Schaal 烘箱法对海鱼进行加速氧化处理。将海鱼处理后制成15 g 左右的鱼片，晾干后置于（60±1）℃烘箱中加速氧化，每隔3 d 取样用于SPME-GC-MS 分析挥发性物质含量的变化、TBA 值测定及感官评定。

1.2.5 感官评定

感官评定参考《食品安全国家标准 动物性水产制品》（GB 10136—2015）[14]。选择对气味相对较为敏感的8 人组成感官评定小组，对加速氧化试验进行气味评价。

1.2.6 TBA 值测定[15]

取10 g 绞碎后的鱼肉，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1% EDTA），振摇30 min，过滤，取10 mL 上清液，加入10 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸（TBA）溶液，100 ℃水浴30 min，冷却，以10000 r/min 离心5 min，向上清液中加入10 mL氯仿摇匀，静置分层，取上清液分别在532 nm 和600 nm 处比色，记录吸光值，并计算TBA 值。

TBA 值（mg/100g）=（A532－A600）/155×10-1×72.6×100

与TBA 反应的物质的量（TBA）以每100 g 肉中丙二醛的毫克数来表示。

2 结果与讨论

2.1 常见海鱼脂肪氧化小分子挥发物含量测定

脂肪氧化产生的小分子挥发物1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛，因阈值较低，在含量较少时有特有的香味，对新鲜鱼肉的总体风味起到重要的作用[16]。本实验利用SPME-GC-MS 的归一法测定了常见新鲜海鱼（鲳鱼、黄鱼、鳗鱼、鳕鱼、马鲛）中上述4 种小分子挥发物的含量，结果见表1。

表1 常见海鱼中4 种小分子挥发物相对含量Tab.1 Relative contents of four small molecule volatile compounds in common marine fish

由表1 可知，5 种海鱼样品中均检测到1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛化合物，其中黄鱼中检出量高于其他鱼类。因鱼肉氧化变质产生“哈喇味”与此类物质密切相关[10]，为客观建立脂肪氧化分析的新方法，课题组以黄鱼为对象，开展加速氧化试验。测定与脂肪氧化密切相关的小分子挥发物1-辛烯-3 醇、己醛、庚醛、壬醛含量，进一步明确脂肪氧化程度与此类小分子化合物的含量关系。

2.2 黄鱼脂肪加速氧化试验小分子挥发物含量测定

Schaal 烘箱法是最常用的脂肪加速氧化方法，用以推测试样的贮藏时间，一般脂肪在（60±1）℃烘箱中1 d，相当于常温下放置1 个月。本实验对黄鱼进行0 d、3 d、6 d、9 d、12 d 和15 d 加速氧化处理，利用SPME-GC-MS 的内标法定量，对试样中的1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛含量进行测定，并进行加标回收实验，结果见表2、表3、图1 和图2。

表2 1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛的GC-MS 标准曲线Tab.2 Standard GC-MS curves of 1-octene-3-ol,hexanal,heptanal and nonanal

表3 己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的GC-MS 回收率Tab.3 The recovery of hexanal,heptanal,nonanal and 1-octene-3-alcohol by GC-MS

图1 黄鱼片加速氧化后1-辛烯-3-醇的含量Fig.1 The content of 1-octene-3-alcohol in the fish fillets of yellow croaker after accelerated oxidation

图2 黄鱼片加速氧化醛类化合物的含量Fig.2 The content of aldehyde compounds content in the fish fillets of yellow croaker after accelerated oxidation

由表2、表3 可知，采用内标法测定己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇，其线性范围均在样品预设的范围内，相关系数R2均在0.9947 以上；内标法的回收率均大于80%，可以满足样品中己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的测定需求。

由图1 可知，1-辛烯-3-醇的含量在6～9 d增加明显，为0～4 d 增加量的1.5 倍左右。1-辛烯-3-醇是花生四烯酸氧化产物，其含量越高，腐败气味越强烈，是引起鱼类异味的重要组分[17]。Iglesias 等[18]也把1-辛烯-3-醇检测量用于监测冷冻马鲭鱼肌肉脂肪的氧化程度。醛类物质是油酸、亚油酸、亚麻酸的氧化产物，己醛在低浓度时呈现蔬菜和水果的清香味，随着浓度增大，其酸败味、恶臭味越来越浓[19]。庚醛、壬醛在低浓度时分别呈现类似甜杏、坚果香气和橙子及玫瑰香味，随着浓度增高，强烈地令人不快且刺鼻的气味越来越大[20]。图2 中醛类物质含量亦从第6 天开始均明显增加，其中己醛上升最为明显，6～9 d己醛含量增加了0.206 μg/g。醛类物质含量增加的原因可能是随着氧化时间的增加，脂肪水解、氧化程度加快[7-8]，试样中与脂质氧化密切相关的1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、壬醛等4 种小分子挥发性化合物含量亦随之增长。

2.3 SPME-GC-MS 法与感官评定、TBA 值测定比较

本课题组应用目前食品行业普遍使用的感官评定[11]、TBA 值测定[12]对黄鱼试样进行氧化程度分析，以验证利用SPME-GC-MS 建立的方法是否具有客观性、可行性。结果见表4、图3。

表4 黄鱼片加速氧化试验的感官评定Tab.4 Sensory evaluation of accelerated oxidation test for yellow croaker fillets

图3 黄鱼片加速氧化试验TBA 值的变化Fig.3 Changes of TBA values in the accelerated oxidation test of yellow croaker fillets

由表4、图3 可知，试样加速氧化过程中，随着氧化时间增加，感官气味的变化与TBA 值的变化趋势较为一致，在0～12 d 中，试样的TBA 值呈上升趋势，哈喇味也越来越重；TBA 值在6 d 后明显上升，哈喇味也是明显发生变化。

为建立评价脂肪氧化程度的新方法，本研究将SPME-GC-MS 法测定黄鱼片加速氧化0～15 d后的己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇挥发物含量与TBA 值作了线性回归方程，其相关系数R2分别为0.9911、0.9625、0.9838、0.9832，均在0.96 以上，相关性显著。

采用相似方法测定了鲳鱼、鳗鱼、鳕鱼、马鲛鱼试样，结果一致。由此可知，测定海鱼脂肪氧化程度不仅可以通过感官气味评价、TBA 值测定，也可以己醛、庚醛、壬醛和1-辛烯-3-醇的含量作为脂肪氧化变质的指标，利用SPME-GC-MS 法进行分析评价。相较感官气味评价，SPME-GCMS 法受人为影响更小，评价结果更具客观性。

3 小结

利用SPME-GC-MS 法测定常见海鱼氧化过程中氧化物己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇含量的变化趋势，其结果与感官气味的变化较为一致，与TBA 值的变化相关性显著。海鱼脂肪氧化过程较为复杂，感官评价受主观性影响，TBA 只检测产物醛的含量，忽略了醇、酮、酸等含量。SPME-GC-MS 法作为脂质氧化分析新方法，己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇可作为判断海鱼脂肪氧化变质度的指标，评价脂质氧化程度更客观、全面。