UPLC-MS/MS 法测定盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪

2021-08-06邵红霞秦秋明

浙江化工 2021年7期

邵红霞，汪辉，秦秋明

（上海微谱化工技术服务有限公司，上海 200438）

盐酸法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，其分子结构为5-异喹啉磺酰胺衍生物，是RHO 激酶抑制物，通过增加肌球蛋白轻链磷酸酶的活性扩张血管，降低内皮细胞的张力，改善脑组织微循环，不产生和加重脑的盗血，同时可拮抗炎性因子，保护神经抗凋亡，促进神经再生[1-2]。盐酸法舒地尔注射液于1995 年在日本上市，在临床上用于蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛等引起的缺血性脑血管疾病症状的改善[3～4]。

盐酸法舒地尔的合成是以5-异喹啉磺酸为起始原料，首先与氯化亚砜形成5-异喹啉磺酰氯盐酸盐，然后与高哌嗪反应获得法舒地尔，再进一步成盐、精制，制得盐酸法舒地尔[5]。盐酸法舒地尔合成路线不是很长，起始原料有可能会残留在工艺过程之中；另外，盐酸法舒地尔潜在的一种降解方式是5-异喹啉磺酸和高哌嗪解离，降解后产生高哌嗪[6]。因此，为了严格控制盐酸法舒地尔注射液的质量，需要对其中的高哌嗪进行检测。

高哌嗪没有紫外吸收，极性大，不易用液相分析。目前普遍采用离子色谱法进行检测。张锦梅等[7]采用非抑制电导离子色谱法对高哌嗪进行了测定，但灵敏度较低。陈梅兰等[8]采用抑制性离子色谱法对盐酸法舒地尔原料中高哌嗪进行测定，灵敏度高，但样品需过固相萃取小柱，操作繁琐。近期，杨万运等[9]公开了一种高哌嗪的高效液相检测方法，利用衍生化试剂将荧光基团加在高哌嗪的氨基上，再利用高效液相色谱法进行定性和定量分析，缺点是需要柱前衍生，耗时费力。本文通过探索研究，将样品稀释后有机相萃取进样，无需样品固相小柱净化或衍生，采用超高液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆质谱法（UPLCESI-MS/MS），建立了在4 min 内快速、高效测定盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪含量的方法。经方法学验证，该法灵敏度高、专属性强、精密度好、回收率良好，可准确测定盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的含量。

1 实验部分

1.1 仪器

ACQUITY I CLASS &QTRAP 4500 超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪，XPR206DR/A 型十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO 公司），Direct 8 超纯水仪（密理博公司），XW-80A旋涡混合器（常州阿米勒仪器科技有限公司）。

1.2 对照品与试剂

对照品：高哌嗪，含量为99.99%，批号为L8A0T61，购自北京百灵威科技有限公司。

试剂：乙腈，质谱纯，购自LiChrosolv；甲醇，质谱纯，购自SIGMA-ALDRICH；氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯，购自GENREAL-REAGENT；甲酸，纯度为98%，购自Adamas-beta；纯化水为Direct 8 制备的超纯水。

样品：国内某药企盐酸法舒地尔注射液加速6 个月试验（40 ℃/75%RH）及长期12 个月试验（30 ℃/65% RH）样品（批号：FAIRM002、FAIRM003、FAIRM004），规格为2 mL：30 mg。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱质谱条件

色谱、质谱条件等参数见表1～表3。

表1 色谱条件

表2 流动相梯度表

表3 质谱参数

1.3.2 溶液的制备

（1）稀释剂：1 mol·L-1的氢氧化钠溶液。

（2）萃取剂：乙腈。

（3）对照品母液

称取高哌嗪标准物质52.390 mg 置于10 mL棕色样品瓶中，用纯化水溶解后稀释至刻度，摇匀；量取上述溶液229.0 μL 置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到浓度为120.0 μg·mL-1的对照品母液。

（4）对照品溶液

量取对照品母液100.0 μL 置于20 mL 棕色样品瓶中，加入稀释剂10.00 mL，混匀，再加入萃取剂10.00 mL，最后加入氯化钠至底部呈现流沙状，涡旋0.5 min，静置5 min，取上层溶液约1 mL 置于2 mL 棕色进样小瓶中，得到浓度为1200 μg·L-1的对照品溶液。

（5）供试品溶液

量取样品400.0 μL 置于20 mL 棕色样品瓶中，加入稀释剂9.600 mL，混匀，再加入萃取剂10.00 mL，最后加入氯化钠至底部呈现流沙状，涡旋0.5 min，静置5 min，取上层溶液约1 mL 置于2 mL棕色进样小瓶中，上机测试。

2 结果与分析

2.1 前处理的优化

对前处理样品稀释剂进行了详细考察。比较了高哌嗪分别用纯水、0.1%甲酸、1 mol·L-1氢氧化钠水溶液稀释后再用乙腈萃取的回收率和稳定性。结果发现，将高哌嗪用1 mol·L-1氢氧化钠水溶液稀释后再用乙腈萃取具有较高的回收率，且结果稳定。推测可能是因为盐酸法舒地尔注射液呈酸性，碱性的稀释剂有利于高哌嗪从酸性溶液中游离出来，提高萃取率，从而增加了回收率。

2.2 供试品溶液保存条件

盐酸法舒地尔注射液说明书中明确贮藏条件为遮光、密闭保存。试验中发现供试品溶液若不避光保存，则回收率明显偏高，推断盐酸法舒地尔易见光降解成高哌嗪。将供试品溶液使用棕色瓶避光保存后回收率正常，且在室温下24 h 稳定，故分析过程中应注意将供试品溶液避光放置。

2.3 质谱参数的考察

对质量浓度为1 mg·L-1的高哌嗪溶液在电喷雾离子源（ESI）下进行一级质谱母离子扫描，结果表明，在ESI 正离子模式下高哌嗪有更好的响应，母离子为101；进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片，确定丰度较高的子离子为定量离子，最终确定响应丰度较高的离子为84.1 和58.1。确定定量离子为58.1Da 后，继续在多反应监测模式（MRM）下优化最佳去簇电压（DP）和最佳碰撞能量（CE），以达到最佳的检测灵敏度，参数优化后的结果见表4。

表4 UPLC-MS/MS 的扫描参数

2.4 专属性考察结果

将试剂空白溶液、对照品溶液和供试品溶液分别进样测试，高哌嗪出峰处无干扰，专属性良好。结果见图1（对照品溶液谱图）和图2（供试品溶液谱图）。

图1 对照品溶液谱图

图2 盐酸法舒地尔注射液谱图

2.5 线性与范围结果

量取对照品母液30.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、150.0 μL、200.0 μL，分别于20 mL 棕色样品瓶中加入稀释剂10.00 mL，混匀，再加入萃取剂10.00 mL，最后加入氯化钠至底部呈现流沙状，涡旋0.5 min，静置5 min，配制360～2400 μg·L-1五个系列浓度的标准溶液，取上层溶液约1 mL 置于2 mL 棕色进样小瓶中。按表1～表4 试验条件测定，以目标物的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，线性结果：Y=92.5X+517，r=0.9977，见图3，表明高哌嗪在360～2400 μg·L-1范围内呈良好的线性关系。

图3 高哌嗪线性拟合谱图

2.6 检测限结果

取高哌嗪对照品溶液逐步稀释，以S/N≈3 时检测限浓度为60 μg·mL-1，相当于限值浓度的5%。

2.7 重复性结果

量取样品母液400.0 μL 置于20 mL 棕色样品瓶中，加入高哌嗪标准储备液100.0 μL，加入稀释剂9.600 mL，混匀，再加入萃取剂10.00 mL，最后加入氯化钠至底部呈现流沙状，涡旋0.5 min，静置5 min，取上层溶液约1 mL 置于2 mL 棕色进样小瓶中，上机测试。配制6 份，试验结果见表5。

表5 重复性试验结果

2.8 准确度结果

量取样品母液400.0 μL 置于20 mL 棕色样品瓶中，分别加入高哌嗪标准储备液30.0 μL、100.0 μL 和150.0 μL，加入稀释剂9.600 mL，混匀，再加入萃取剂10.00 mL，最后加入氯化钠至底部呈现流沙状，涡旋0.5 min，静置5 min，取上层溶液约1 mL 置于2 mL 棕色进样小瓶中，上机测试，每个准确度水平平行配制3 份，试验结果见表6。

表6 准确度试验结果

2.9 溶液稳定性结果

取新鲜配制的对照品溶液和100%准确度水平溶液（置于棕色小瓶避光保存）作为0 h 稳定性考察溶液，于0 h、3 h、6 h、18 h、24 h 分别进样，各时间点与零点的浓度比值在93%～103%之间，表明对照品溶液和供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.10 耐用性结果

改变流速（±10%）、柱温（±1 ℃）、流动相中甲醇比例（±5%）后，100%准确度水平供试品溶液中高哌嗪含量RSD 不超过1%。表明本方法的耐用性较好。

2.11 样品检测及安全性评估

高哌嗪是盐酸法舒地尔合成工艺中用到的一种原料，同时也是其降解杂质，根据药监局的相关要求，盐酸法舒地尔中高哌嗪的含量不得超过0.1%，其注射液中高哌嗪的含量不得超过0.2%[10]。取国内某药企3 批样品（批号：FAIRM002、FAIRM003、FAIRM004）加速6 个月试验（40 ℃/75%RH）及长期12 个月试验（30 ℃/65%RH），按1.3.2 项方法制备样品及对照品溶液，按表1～表4 条件测定。结果表明，3 批加速6 个月及长期12 个月样品中高哌嗪含量均未检出，即低于检测限（100%限值浓度的5%）。表明该药企盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的安全风险较低。