北京市大兴地区13200例女性宫颈HPV感染状况及亚型分析

于 帅 宋风丽 刘红巧 高万里

北京市大兴区人民医院 (102600)

宫颈癌为女性生殖系统恶性肿瘤[1]。人乳头瘤病毒(HPV)目前已发现100多种类型，其中40余种与生殖道疾病关系密切。有研究表明，90%以上宫颈鳞癌中可检测出HPV高危型别，持续感染HPV为导致宫颈癌的重要因素[2]。注射宫颈癌疫苗预防宫颈癌作用显著，明确地区间HPV基因型分布及混合感染的基因型对治疗及预防宫颈癌意义重大[3]。本研究检测大兴地区女性体检13200例宫颈上皮细胞中HPV基因分型，分析辖区内女性宫颈HPV感染状况及亚型分布情况，为预防提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料

选取2017年5月—2019年12月在本院体检的来自大兴地区女性作为研究对象。纳入标准：①无锥切手术史、宫颈环切史；②初次行HPV检测，无HPV感染史；③知情本研究内容并签署同意书。排除标准：①合并其他宫颈疾病者；②对本研究依从性差；③合并其他感染性疾病。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 试剂与仪器

高危型HPV分型核酸检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，全自动医用PCR分析系统(SLAN-96P，上海宏石医疗科技有限公司)，全自动核酸检测处理系统Autrax193购自上海之江生物医药科技有限公司，生物安全柜(HFsafe1200Class)购自上海力申科学仪器有限公司。

1.3HPV检测

常规采集标本[4]。提取DNA模板：取适量组织在液氮中研磨，并在其中加入细胞裂解液进行裂解，再加入RNass及蛋白酶K进行消化，再一次用苯酚、氯仿、异丙醇等抽提，清洗沉淀用乙醇，在以TE回溶。引物设计：扩增反应选择HPV晚期编码蛋白的LI区中通用引物GP5+/6+，引物序列GP6+为5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATT-C-3’，GP5+为5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’，引物采用HPV通用引物委托上海生工合成。在GP5+/6+通用引物扩增片段内设计HPV16/18特异性探针，其中HPV18为HEX-5’-CTTCTACACAGTCTCCTGTA-3’-BHQ，HPV16为FAM-5’-TCATTATGTGCTGCCATAT-3’-BHQ，探针为自主设计委托上海生工合成并修饰。HPV16/18阳性质粒构建：在实验室试验片段重叠延伸法分别构建HPV16/18阳性质粒，依据NCBI公布的DNA序列，各人工合成两条80bp长的片段，重叠、中间互补15个碱基。先将两个有重叠序列的片段在PCR体系中重叠延伸15个循环，模板为延伸产物，在Taq酶作用下，第二轮PCR以上下游引物(GP5+/6+)扩增HPV DNA。在1%琼脂糖凝胶PCR产物电泳，检测片段大小，确定目的片段后回收产物，将其与pMD-19T载体连接后在大肠杆菌DH5α感受态细胞中转化，得到HPV16/18阳性质控。使用实时荧光定量PCR检测仪扩增，反应体系25μl中含有GP5+引物0.4μmol/L、GP6+引物中0.4μmol/L、0.6μmol/L Taqman探针，2.5U Taq酶，dNTP 0.5μmol/L，及10×buffer(Mg2+)2.5μl及5μl 阳性质粒或者DNA模板，以蒸馏水为空白对照。扩增条件：95℃下3min预变性，95℃下20s变性，在45℃下45s退火，72℃ 30s延伸，共计40个循环，于退火阶段采集荧光信号，结束后10min延伸。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 不同年龄段女性HPV阳性分布

共纳入检测13200例，年龄18～78岁，HPV感染2251例，感染率为17.1%。各年龄组均以单一感染为主，阳性感染以21～30岁为主，HPV感染率以<21岁者最高。各年龄组间感染率有差异(P<0.05)。见表1。

表1 各年龄段HPV感染情况[例(%)]

2.2HPV感染者各亚型分布

2251例HPV阳性者共检测各亚型3215项次，其中低危亚型检测454项次(14.1%)，以HPV6、11、CP8304为主；高危型2716项次(85.9%)，以HPV16、58、52、53为主。见表2。

表2 HPV感染者各亚型分布

2.3HPV感染类型

2251例感染HPV者以高危型、单一感染为主，HPV多重感染者中以高危型、双重感染为主。见表3。

表3 感染HPV类型分布[例(%)]

3 讨论

宫颈癌为临床常见妇科恶性肿瘤，病死率居全球第二，以HPV持续感染为癌前病变及宫颈癌发生发展的必要条件[5]。截止目前，临床可检测100多种HPV基因型，且宫颈病变的级别与HPV感染基因型有一定关系，临床根据病毒致癌性主要分为两类[6]：高危型HPV，与高度宫颈鳞状上皮内瘤变及宫颈癌的发生关系密切；低危型HPV，常引发低度宫颈鳞状上皮内瘤变及生殖器湿疣等良性病变[7]。高危型HPV持续感染进而使细胞生长周期调控发生异常，导致细胞不停增殖并逐渐恶化，最终引发浸润性宫颈癌[8-9]。早期发现、早期干预对防控宫颈癌，降低其发病率、死亡率意义重大。

不同地区和国家HPV感染亚型及感染率分布差异较大，了解本地区HPV感染现状及HPV基因型分布可为本地区人群进行针对性预防接种，对高发人群行干预及监测降低感染HPV病毒及患宫颈癌风险，是目前预防宫颈癌发生发展较有效措施[10]。本研究对体检的13200例女性HPV基因检测结果显示，HPV感染阳性率为17.1%。与张建海等报道阳性率20.64%相近[11]。但与郝慧静报道的北京昌平区HPV感染阳性率(10.21%)[12]差别较大，可能与所处地理位置不同，及人口流动性影响有关。本研究HPV阳性者中以HPV16(22.3%)、HPV58(18.5%)、HPV52(17.4%)、HPV53(14.1%)4种类型最为常见，在各年龄段女性中均居首位，与相关研究结果一致[13-14]；其次为HPV58、HPV52两种类型，与亚洲人群特征相符。而低危型HPV感染占所感染者20.2%，以HPV11为主。在所有各亚型阳性HPV总体项次中，高危型占总项次85.9%，低危型占14.1%，说明本地区HPV感染的主要亚型为高危型HPV，应在治疗中引起足够重视。

感染HPV亚型分布地域性较强，本研究HPV亚型与其他地区不全部一致。王睿报道山东地区高危HPV亚型前5位分别为HPV16、52、58、56、53[15]，杨翠翠等报道临沂市高危HPV亚型前5位分别为HPV16、52、58、51、53[16]。各个地区HPV16均占主要地位，但其他亚型地域性明显，故明确地区主要流行的HPV亚型对预防和治疗女性HPV相关生殖道疾病意义重大。本研究结果显示，高危型单一感染为本地区女性感染HPV的主要类型，占全部感染的76.3%；多重感染占所有感染者18.1%，以高危型双重感染为主。提示本地区应对高危型单一感染患者加强治疗及随访，对多重感染者尤其是双重感染者应以监控为主。

有研究显示[17]，年龄也是影响宫颈癌发生及HPV感染的重要因素。本研究显示，阳性感染者主要以21～30岁、31～40岁为主，HPV感染率以<21岁者最高。推测与20～40岁人群生理特征有关，为性活跃人群。由于HPV感染发生多呈现出一过性，一般于8～10个月内可清除，但宫颈癌发病率随年龄增长而上升。因此应对20～40岁人群HPV感染给予高度重视并积极干预，减少发展为宫颈癌。

综上所述，本院调查的本地区女性HPV阳性率为17.1%，以高危型单一感染为主，其中感染亚型以HPV16、HPV58、HPV52、HPV53为主。