外周血胎儿游离DNA无创产前检测诊断染色体异常及假阳性原因分析

陈玫君 田艳红 郭飞波

湖北省天门市第一人民医院(431700)

在新生儿出生缺陷中染色体异常是最常见病因，产前检查常采用超声影像学筛查及血清学检测评估胎儿出生缺陷风险，但存在检测精度和准确性不高等缺点[1]。介入性羊水染色体核型分析产前诊断准确性达98%～99%，成为胎儿染色体异常及出生缺陷诊断金标准[2]。但羊水穿刺可增加宫内感染、羊水渗漏、流产等风险，且不适用于所有孕妇。1997年LO[3]开创了利用孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测(NIPT)。目前NIPT已广泛用于产前21-三体、18-三体、13-三体、性染色体等染色体异常检测，检测敏感性与特异性显著提升。然而大量临床实践[4]，NIPT假阳性时有发生，与羊水穿刺核型检测相比假阳性发生率为0.1%～0.3%，限制了NIPT广泛应用。目前针对NIPT检测染色体异常的研究较多，但鲜有关于探究NIPT假阳性的相关报道。鉴于此，本研究分析了NIPT诊断染色体异常的应用价值，重点分析NIPT假阳性缘由，为提高NIPT临床应用提供参考与借鉴。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年7月—2019年12月于本院行NIPT的单活胎孕妇10236例临床资料，年龄(28.7±8.5)岁(19～47)岁，孕周(19.6±5.4)周(11～23)周。纳入标准：①经B超检查确定孕周11～23周；②单胎妊娠；③知情同意且自愿行NIPT检测。排除标准：①染色体异常；②接受过移植手术、干细胞治疗或短期输注异体血液制品、免疫治疗等。NIPT检测阳性孕妇，根据本人及家属意愿行羊膜腔穿刺胎儿染色体核型分析。对NIPT假阳性且孕妇自愿继续妊娠分娩者行NIPT假阳性原因分析。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 检测方法及评估

采集孕妇空腹外周静脉血浆， 4℃恒温离心处理后取上层血浆，采用德国Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒提取胎儿游离DNA。采用文库构建试剂盒(中国博奥公司)构建测序文库，采用高通量基因测序技术进行样本测序检测。计算每条染色体reads所占比例及Z值，评估染色体非整倍体异常情况。对NIPT检测提示高风险者，向孕妇及家属进行遗传咨询与羊膜腔穿刺胎儿染色体核型分析建议，并告知侵入性产前诊断风险，签署知情同意书。B超引导下经孕妇腹羊膜腔穿刺取羊水20ml，常规处理后，采用ISCN2016计数与核型分析，提示NIPT假阳性且孕妇自愿继续妊娠并分娩者，于孕妇分娩后采集孕妇静脉血，按NIPT检测方法对样本进行处理与高通量DNA测序检测。采集胎盘组织样本，生理盐水清洗母血经处理后采用高通量DNA测序检测胎盘组织中染色体情况。NIPT检测结果提示染色体非整倍体疾病高风险，而经羊水穿刺胎儿染色体核型分析正常，则认为NIPT假阳性。

2 结果

2.1NIPT检测

10236例孕妇，IPT检测染色体异常111例，检出率1.1%。其中21-三体异常34例(30.6%)，18-三体异常20例(18.0%)，13-三体异常17例(15.3%)，性染色体异常35例(31.5%)，其他染色体异常5例(4.5%)。

2.2 不同方法检测及妊娠结局对比

NIPT检测提示异常者行羊膜腔穿刺检测复核，其中确诊92例(92/111，82.9%)，未见异常19例(19/111，17.1%)，总假阳性率为0.2%(19/10236)。见表1。

表1 不同方法检测及妊娠结局对比

2.3 假阳性原因验证分析

19例NIPT假阳性孕妇继续妊娠并分娩，经与胎盘组织、母血样本对比发现，12例胎盘组织检测结果与NIPT结果一致；5例母血检测结果与NIPT结果一致； 2例无法确定NIPT假阳性原因。见表2。

表2 19例不同标本NIPT检测异常原因分析(例)

3 讨论

染色体非整倍体疾病是新生儿出生缺陷的主要原因，可通过产前诊断采取必要终止妊娠[5]。常规B超检查和血清学检测无法作为染色体异常的筛查手段，孕妇外周血中游离DNA为产前无创诊断提供了新的思路。相关研究证实[6]，孕妇在孕10周时外周血即可检测到150bps胎儿DNA片段，此片段基本包含胎儿所有基因组序列，通过检测孕妇外周血游离DNA即可获得胎儿染色体情况。因此孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测(NIPT)逐渐成为新生儿出生缺陷产前检测的新宠。

我国卫生部于2012年组织NIPT技术论证，但随着假阳性案例报道增多，卫生部于2014年停止了NIPT检测。随后通过设立多家试验点充分临床评估后，于2016年发布有序开展NIPT检测通知，并对21-三体、18-三体、13-三体、性染色体等检出率做出规定[7]。近年临床实践及研究发现，NIPT对染色体异常检出率不尽相同。纪巍[8]等报道NIPT对21-三体异常预测值为100.00%，对18-三体异常预测值为66.67% ，对13-三体异常预测值为50.00%；左娟等[9]报道NIPT对21-三体、18-三体、13-三体、性染色体检出率分别为88.9%、88.9%、50%、83.9%。本研究染色体异常检出率(1.1%)与文献报道[10-11]NIPT阳性检出率较一致。相比传统产前诊断方法，NIPT对21-三体、18-三体、13-三体、性染色体灵敏度均较高，尤以对21-三体灵敏度最高。本研究通过与羊水穿刺胎儿染色体核型分析结果对比，显示NIPT总体假阳性率(0.2%)与罗丽等双[12]报道结果一致。提示NIPT并非对所有染色体异常阳性预测值均持续敏感，考虑NIPT对倒位、易位等染色体结构表现不敏感，因此会产生假阳性或假阴性，从而影响到检测诊断结果。因此，NIPT虽然是一种较好的无创产前诊断手段，但并不能彻底取代产前诊断传统核型分析方法。

相关研究证实胎儿与胎盘的组织遗传物质相同[13]。而孕妇外周血游离DNA绝大部分来源于胎盘滋养层细胞，故正常情况下通过检测孕妇外周血胎儿游离DNA可获得与胎儿组织相同的检测结果。然而，胎盘细胞系增殖过程可能出现有丝分裂错误，形成部分异常染色体组织结构，并与正常染色体胎盘组织结构嵌合在一起，形成限制性胎盘嵌合体，胎儿染色体核型依旧正常。这种情况下若胎盘异常染色体细胞释放游离DNA，经NIPT检测即可发现异常，而胎儿染色体正常，即为假阳性。本研究中19例假阳性中12例胎盘组织检测结果与NIPT结果一致，提示限制性胎盘嵌合体导致胎盘来源染色体异常是NIPT假阳性的主要因素之一。孕妇外周血游离DNA大部分来源于母体，虽然经过严格分离与纯化处理，但样本中仍会存在部分DNA片段影响胎儿游离DNA检测，同样会表现NIPT假阳性。此外，女性拥有两条X染色体，外周血中可能存在小片段染色体缺失或重复，从而检测孕妇外周血游离DNA时常见染色体异常[14]。本研究19例NIPT假阳性中5例母血检测结果与NIPT结果一致，且其中4例为性染色体异常假阳性，说明母血异常DNA可能是导致NIPT假阳性的另一原因。临床公认NIPT适用孕周为12～26周，由于NIPT检测所需胎儿游离DNA并非来源于胎儿本身而是胎盘，游离DNA含量<4%时NIPT假阳性率高。因此必须要求孕周>12周才能保证充足游离DNA以满足检测要求[15]。而<26周则是为产前诊断预留充分时间以备相应干预。本研究中2例孕11周接受NIPT检测均为假阳性，可能与NIPT检测时孕周不足12周导致外周血胎儿游离DNA量不足所致。需要说明的是，由于本研究中NIPT假阳性病例样本量少，发生机理及确切原因仍需深入研究。

总之，NIPT在产前胎儿染色体异常诊断中具有较高检出率，但不排除假阳性可能须引起足够重视。研究结果初步揭示胎盘中异常游离DNA进入母血、母血已有异常游离DNA以及孕周不足是导致NIPT假阳性的主要原因，提示临床实验室必须严格NIPT检测规范，确保NIPT检测有效性。针对NIPT假阳性问题必须联合其他检测手段排除胎儿染色体异常可能。