ADRP、NADH、HSP70在妊娠高血压疾病患者胎盘组织中的表达及意义

李园春 刘 耘

1.河北省唐山市丰南区医院(063300) 2.河北省唐山中心医院

妊娠高血压疾病临床特征表现为原因不明的全身小血管痉挛，与血管内皮功能紊乱、胎盘缺氧、细胞凋亡等因素密切相关，无特异性表现[1]。可引发肾衰竭、心力衰竭、胎盘早剥、肺水肿以及产后出血等多种并发症，属高危妊娠范畴[2-3]。缺乏早期筛查的特异性指标。本文分析脂肪分化相关蛋白(ADRP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶、热休克蛋白70(HSP70)在妊娠高血压疾病患者胎盘组织中的表达变化，为临床早期筛查和疾病评估提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年2月—2020年2月本院收治的152例妊娠高血压疾病患者为高血压组，同期110例健康产妇为健康对照组。纳入标准：妊娠高血压符合相关指南诊断标准[4]，近2周内未使用相关药物干预，单胎妊娠；健康对照组产妇身体健康，无妊娠期合并症。所有研究对象均配合研究且自愿参与。排除标准：合并妊娠期糖尿病、肝内胆汁淤积症、心脏病等其他妊娠期合并症；多胎妊娠；原发性高血压；合并甲亢、甲减等内分泌系统疾病；甲状腺系统疾病；孕前合并高血压疾病者；精神、沟通障碍。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2ADRP、NADH、HSP70检测

在所有研究对象胎盘娩出后5min内取胎盘中央母体面组织(1cm×1cm×1cm)，避开梗死、钙化、出血区域，分两份，其中一份反复冲洗后置4%多聚甲醛中固定1d后做石蜡包埋，制备4μm石蜡切片，保存备用。另一份在-70℃冰箱保存备用。

1.2.1 ADRP、NADH、HSP70表达将石蜡切片标本在二甲苯脱蜡处理30min，在梯度乙醇中各浸泡5min，无菌蒸馏水清洗5min。在沸水中加入柠檬酸钠抗原修复液水浴20min，冷却到室温，采用PBS清洗3次，每次5min。分别滴加ADRP、NADH、HSP70抗体(1：200)，在4℃湿盒中保存过夜。第2d取出湿盒，复温1 h，采用PBS洗片3次，每次5min。加入二氨基联苯胺(1：50)显色lmin，加入蒸馏水终止反应。加入苏木素复染，盐酸乙醇分化后梯度乙醇脱水，二甲苯冲洗片3次直到透明，采用中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况。随机选取5个视野，病理切片均由2位以上有经验的医师采用双盲法确认。根据染色程度和染色细胞百分比进行评估：阳性细胞数<10%为(-)，10～25%为(+)，25～75%为(++)，>75%为(+++)。

1.2.2 ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量取在冰箱中保存的胎盘组织，采用Trizol法提取胎盘组织总RNA，检测RNA纯度、含量，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理后获得cDNA，采用Primer5.0软件设计引物序列，使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测两组患者治疗前后胎盘组织中ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量。反应体系：0.4μl上下游引物、1μlcDNA模板、10μl SYB Green，加蒸馏水至20μl。反应条件：95℃预变性30s、95℃ 5s、60℃ 31s，共进行40个循环。ADRP引物序列：上游：5’-AGCTGTTGGTAGAACAGTAC-3’，下游：5’-AGATGTCGCCTGCCATCACC-3’；NADH引物序列：上游：5’-CCGCCGCCAAGAAGTATAAT-3’，下游：5’-ACATGTCTAGGTGCCAGTGC-3’；HSP70引物序列：上游：5’-GAGTTTGAGCACAAGAGGAAGG-3’，下游：5’-AAGAAATAGTCGTAAGATGGCAG-3’；内参β-actin引物序列：上游：5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3’，下游：5’-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3’。

1.3 观察指标

分析高血压组(妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期)、健康对照组胎盘组织ADRP、NADH、HSP70表达情况并分析与妊娠高血压组疾病严重程度及临床特征关系。追踪高血压组至妊娠终止，记录羊水过少、胎盘早剥、胎儿窒息、胎儿生长受限等不良妊娠结局发生情况，分为不良妊娠结局组和妊娠结局良好组，分析ADRP、NADH、HSP70之间相关性及与妊娠结局关系。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床资料

高血压组年龄(28.0±3.8)岁(24～35岁)，体质指数(BMI)(27.6±2.4)kg/m2(25～33 kg/m2)，孕周(38.0±2.0)周(36～40周)；初产妇70例，经产妇82例；妊娠期高血压62例，轻度子痫前期41例，重度子痫前期49例。健康对照组，年龄(27.1±4.8)岁(22～35岁)，BMI(27.7±2.2)kg/m2(25.3～32.9 kg/m2)，孕周(38.5±2.5)周(36～41周)；初产妇52例，经产妇58例。两组对比无差异(P>0.05)

2.2 胎盘组织中ADRP、NADH、HSP70表达

与健康对照组相比，高血压组胎盘组织中ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量升高(P<0.05)。见表1、图1(856页)。

表1 两组胎盘组织中各mRNA表达情况对比

2.3ADRP、NADH、HSP70与妊娠高血压疾病程度关系

随着妊娠高血压疾病加重，患者ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量逐渐升高(P<0.05)。见表2。

表2 各mRNA与妊娠高血压疾病程度关系

2.4ADRP、NADH、HSP70与妊娠高血压疾病临床特征关系

ADRP、NADH、HSP70表达与妊娠高血压患者年龄、BMI、孕产次无关(P>0.05)，与患者家族子痫前期史、家族高血压史、尿蛋白水平有关。与无家族子痫前期史、无家族高血压史、尿蛋白水平+、++的患者相比，有家族子痫前期史、有家族高血压史、尿蛋白水平+++的患者ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量升高(P<0.05)。见表3。

表3 各mRNA与妊娠高血压患者临床特征关系

临床特征 例数ADRP mRNAt/FPNADH mRNAt/FPHSP70 mRNAt/FP子痫前期家族史8.3500.00112.3100.00115.2200.001 有321.86±0.331.98±0.382.02±0.39 无1201.45±0.221.34±0.221.22±0.22高血压家族史11.6500.00116.6800.0017.7800.001 有281.95±0.541.85±0.161.86±0.35 无1241.21±0.221.32±0.151.33±0.32尿蛋白18.0110.00128.1030.00123.8950.001 +591.05±0.221.13±0.131.11±0.16 ++431.52±0.261.76±0.211.56±0.21 +++502.03±0.582.05±0.351.92±0.35

2.5ADRP、NADH、HSP70与妊娠高血患者妊娠结局关系

妊娠高血压疾病患者中，妊娠结局不良组ADRP、NADH、HSP70 mRNA表达量高于妊娠结局良好组(P<0.05)。见表4。

表4 各mRNA与妊娠高血压疾病患者妊娠结局关系

2.6ADRP、NADH、HSP70相关性

Pearson分析显示，ADRP与NADH呈正相关(r=0.309,P=0.001)，ADRP与HSP70呈正相关(r=0.265,P=0.001)；NADH呈HSP70之间正相关(r=0.254,P=0.002)。见图2(856页)。

3 讨论

妊娠高血压疾病临床较常见，长期处于持续的高血压状态可引发机体脐动脉血流异常、母体多器官功能损伤等，威胁着母婴健康，是导致围产期母婴死亡的主要原因之一。多数研究显示，此病的发生与血管内皮功能紊乱、胎盘和滋养细胞缺氧缺血、免疫因素、脂代谢异常以及遗传因素等[5-6]。虽然研究显示妊娠高血压疾病与多因素相关，但仍缺乏特异性诊断指标。

ADRP基因与脂代谢异常过程相关，属一种分子量为48.1KDa的膜相关蛋白，分布于人类的内皮细胞、巨噬细胞、培养的细胞系纤维母细胞中[7]。主要生物学功能包括促进长链脂肪酸的吸收、调节巨噬细胞中脂质代谢、促进脂质堆积和脂滴形成等[8-9]。目前临床研究显示，ADRP参与多种脂代谢异常疾病的发生，包括糖尿病等，其表达处于异常升高状态[10]。而研究显示[11]，脂代谢异常是妊娠高血压疾病的诱发因素之一，因此推测ADRP可能与妊娠高血压发生发展相关。本文研究显示，ADRP在妊娠高血压患者表现为高表达，且随着疾病的进展表达量加剧，推测可能与患者脂肪代谢紊乱有关。

HSP70属于热休克蛋白家族成员，具有保护细胞免受侵袭的作用，参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等过程[12]。临床研究显示，正常妊娠过程中胎盘发育均伴随着微量的炎症和低氧信号刺激，HSP70处于稳定表达状态利于胎盘正常生长发育[13]。但当母体出现较明显炎症反应时，机体HSP70会异常增多，介导免疫应答反应的发生，参与妊娠高血压疾病的发生发展。临床研究显示，妊娠高血压疾病患者胎盘缺血、氧化应激、血流动力学改变等因素均会加深全面免疫反应程度，介导较多的HSP70产生，增强其表达[14-15]。陈鲲等[16]研究表明，HSP70在妊娠期高血压患者血清中高表达，提示HSP70与妊娠期高血压相关。本文研究结果显示，妊娠高血压疾病患者胎盘组织中HSP70表达增高，且随着疾病进展表达加剧，与妊娠不良结局相关。提示患者存在一定的免疫应答反应，表现为HSP70增加，临床可根据其水平评估患者疾病程度和预测妊娠结局。

NADH属于一种由线粒体重链区的ND1～5所编码的基因，属电子传递链中较重要的黄素蛋白[17-18]。目前已有多数研究显示，NADH基因参与多种疾病的发生发展，如重症肺炎、肝脏疾病等[19-20]。临床研究显示，线粒体属于多种真核生物细胞中的重要细胞器，可经氧化磷酸化过程生成ATP，属于脂肪有氧代谢的场所，当其功能损伤后NADH表达升高[21]。功能低下的线粒体多因脂肪氧化不足产生过量的超氧化物、脂质过氧化物、自由基以及游离脂肪酸等，上述物质的出现均会导致血管内皮损伤。因此推测，NADH可能经损伤线粒体介导血管内皮细胞损伤而诱导妊娠高血压疾病的发生。在本研究妊娠高血压疾病患者胎盘组织中NADH高表达，且与患者疾病严重程度及不良妊娠结局的发生相关。提示，NADH可能参与妊娠高血压疾病的发生进展，临床可根据其表达变化评估此病。

综上所述，妊娠高血压疾病患者胎盘组织中ADRP、NADH、HSP70均为高表达状态，且随着疾病进展而表达加剧，并与妊娠结局相关。临床上可根据其表达评估此病和预测妊娠结局，以改善母婴预后。