江西省啮齿动物携带立克次体分子流行病学研究

卢志宇，闫 鑫，于永慧，丁 晟，夏光辉，周冬生，熊小路，徐建民，焦 俊

立克次体为专性真核细胞内寄生的革兰阴性小球杆菌，其引起的立克次体病是重要的人兽共患自然疫源性疾病[1]。立克次体病原体主要有斑疹伤寒群立克次体(typus-group rickettsiae)、斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia, SFGR)、恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)、无形体(Anaplasma)和埃立克体(Ehrlichia)等，分别引起斑疹伤寒、斑点热、恙虫病、无形体病和埃立克体病。贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)虽然已归类到军团菌目，但其引起的Q热仍归于立克次体病范畴。在自然环境中，哺乳动物，尤其是啮齿类动物是多种立克次体的自然宿主[2]，也是蜱、螨等立克次体传播媒介的自然吸血宿主[3-4]，在立克次体病的流行中起重要作用。

近年来，国内立克次体宿主学研究集中于立克次体节肢动物传播媒介—蜱，发现蜱可携带斑点热群立克次体、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)、查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)、贝氏柯克斯体等[5-6]。而啮齿动物携带立克次体的研究数据相对较少，文献报告多在我国东北林区、新疆戈壁、云南热带雨林、南海岛礁等远离密集人群地区发现啮齿动物携带立克次体[7-15]。

江西省位于我国东南部，属亚热带季风性湿润气候，当地水网稠密，是以水稻为主的重要粮食产区之一，同时也是鼠类等啮齿动物密集活动的重灾区[16]。目前研究发现江西省部分地区的啮齿类动物携带钩端螺旋体等病原[17]，但是罕见境内啮齿动物携带立克次体病原体报告。本研究选择江西省南丰县、铜鼓县、上犹县、浮梁县、上高县、上饶市广信区捕获啮齿类动物，采用立克次体属/群特异性巢式PCR对啮齿类动物脾脏组织DNA样本扩增，再对扩增的阳性DNA片段测序和序列分析，旨在调查此地区啮齿动物携带立克次体病原的种类，以便为当地立克次体病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集 于2019年10月，选择江西省东、南、西、北的南丰县、铜鼓县、上犹县、浮梁县、上高县、上饶市广信区(图1)，在上述地区稻田布置中型板夹，采取夜夹法捕获啮齿类动物。每个采集点每次放置有效鼠夹≥300个，行距30 m，夹距5 m[18]。下午或傍晚放夹，次日凌晨收夹。

图1 在江西省的6个县捕获啮齿动物样本

1.2 样本处理及鼠种鉴定 将捕获的啮齿类动物用75%酒精擦拭体表，于生物安全柜内无菌解剖，取脾脏，将脾脏置液氮罐中冻存备用。捕获的啮齿类动物通过形态学[19]及分子生物学方法进行种类鉴定，分子生物学种类鉴定基于啮齿动物特异的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)[20]和细胞色素b(Cytb)基因[21]。

1.3 DNA提取和巢式PCR扩增 从液氮中取脾脏，无菌剪取约100 mg脾脏组织置于无菌陶珠管中，加入300 μL PBS缓冲液后置于全自动组织匀浆仪7 000 r/min匀浆90 s。充分匀浆后，取适量提取全基因组DNA，其余保存于-80 ℃备用。使用核酸提取试剂盒(Dneasy Blood&Tissue Kit，Qiagen)，按其说明书从脾脏匀浆液中提取DNA。

从文献获取扩增柯克斯体16SrRNA基因[22]、斑点热群立克次体ompA基因[4]、东方体56-kDa基因[23]和无形体和埃立克体16SrRNA基因[24]的属/群特异性引物序列(表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以从鼠脾脏组织中提取的全DNA为模板，采用巢式PCR方法进行扩增。PCR反应总体积为50 μL：ddH2O 21 μL、2×PCR Premix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL，每次扩增均设阴性(水)对照、阳性对照(本实验室留存的立克次体全基因组DNA)。第2次扩增时取第1次扩增产物2 μL为模板。电泳条件为1.5%的琼脂糖凝胶120 V电压下电泳20 min，加样量5 μL/孔。2×PCR Premix和DNA Marker(DL 2000)为宝生物工程(大连)有限公司生产，PCR仪(GeneAmp PCR System 9700)为美国应用生物系统公司产品。

表1 啮齿动物种类鉴定和立克次体特异性PCR扩增引物

1.4 同源性比较和聚类分析 将巢式PCR扩增的阳性DNA片段物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，将获得序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的BLAST界面与GenBank注册基因进行同源性比对，最后用MEGA 7.0软件采用最大似然法(Maximum Likelihood)将新测得的基因序列与相关已知同源序列构建遗传进化树(Bootstrap值设定为1 000)。

2 结 果

2.1 样本采集和鼠种鉴定 从江西省南丰县、铜鼓县、上犹县、浮梁县、上高县、上饶市广信区等地区的稻田，通过夜夹法共捕获啮齿类动物393只，形态学鉴定为黑线姬鼠、褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠和鼩鼱6个种类，并进一步通过分子生物学方法确证。其中黑线姬鼠为优势鼠种，共计311只(79.14%)(表2)。

表2 采集的啮齿动物种类及数量(%)

2.2 巢式PCR检测 采用柯克斯体属、斑点热群、东方体属、无形体属特异性引物对动物DNA样本做巢式PCR扩增。结果从19只黑线姬鼠样本扩增出柯克斯体属DNA(6.11%)，2只黑线姬鼠样本扩增出东方体DNA(0.64%)，从1只黑线姬鼠样本扩增出斑点热群立克次体DNA(0.32%)，从所有黑线姬鼠样本中未扩增出无形体DNA，详见表3。其它5种啮齿类动物样本所有立克次体引物扩增均为阴性。

表3 PCR检出黑线姬鼠的阳性结果

2.3 同源性比对和系统进化分析 将扩得的柯克斯体属16SrRNA基因片段进行测序，结果显示19份样本测得的基因序列一致，同源性分析显示与已知贝氏柯克斯体16SrRNA基因同源性为98.43%～100%。系统进化树分析表明，该菌株与Coxiellaburnetiistr.Schperling(CP014563.1)、CoxiellaburnetiiMSU Goat Q177(CP018150.1)、CoxiellaburnetiiCbuK Q154(CP001020.1)处于同一进化分支(图2)。

图中菌株序列取自GenBank数据库，JX/2019/China为本研究中扩得序列。

将扩得的斑点热群立克次体ompA基因片段测序，同源性分析显示其与已知新塔拉萨维奇立克次体(CandidatusR.tarasevichiae)的ompA基因序列同源性为100%。系统进化树分析表明该菌株与我国东北地区新塔拉萨维奇立克次体(MN450411.2，MN450410.2，MN450409.2，MG888729.1)处于同一进化分支(图3)。

图中菌株序列取自GenBank数据库，JX-Fuliang/2019/China为本研究中扩得序列。

将扩得的东方体属56-kDa基因片段测序，2份样本基因序列一致，同源性分析显示该序列与恙虫病东方体的56-kDa基因序列同源性为100%。系统进化树分析显示该菌株与恙虫病东方体(GU446598.1，JN415556.1，GQ332758.1，LC110350.1)处于同一进化分支，为Gilliam基因型(图4)。

图中菌株序列取自GenBank数据库，JX/2019/China为本研究中扩得序列。

3 讨 论

既往调查研究发现，江西省啮齿动物携带有鼠疫耶尔森菌[25]、广州管圆线虫[26]、汉坦病毒[27]，钩端螺旋体[15]等多种人兽共患病原或寄生虫，但境内啮齿动物携带立克次体鲜有报道。本次研究采用分子生物学方法对江西省南丰县、铜鼓县、上犹县、浮梁县、上高县、上饶市广信区的啮齿类动物携带立克次体的情况进行了调查，发现部分地区黑线姬鼠携带贝氏柯克斯体、新塔拉萨维奇立克次体和恙虫病东方体。

贝氏柯克斯体是重要的人兽共患病—Q热的病原体。本次研究在江西省北部的浮梁县、铜鼓县以及东北部的上饶市广信区的黑线姬鼠检出贝氏柯克斯体，阳性率为6.11%，提示这些地区存在Q热的疫源地，黑线姬鼠是该疫源地贝氏柯克斯体的储存宿主和潜在的Q热传染源。尽管江西目前尚未见Q热疫情报告，但仍有必要对当地临床不明原因发热患者进行Q热筛查。

新塔拉萨维奇立克次体是斑点热群的一新种，于2001年首先在俄罗斯乌拉尔南部和西部、西伯利亚东部的全沟硬蜱(Ixodespersalcatus)中发现[28]，随后我国黑龙江、吉林、河南的全沟硬蜱中也检出该立克次体[29]，王宁等[30]在内蒙西部的长爪沙鼠及五趾跳鼠也检出该立克次体。另外，贾娜等于2012年在我国黑龙江牡丹江地区，首次从患者血样本分离到新塔拉萨维奇立克次体，证实该立克次体可感染人[31]。本次研究中，我们从浮梁县1只黑线姬鼠样本中检出该立克次体，系统进化树显示该立克次体与我国黑龙江、吉林等地蜱中检出的新塔拉萨维奇立克次体处于同一分支，提示除长爪沙鼠及五趾跳鼠外，黑线姬鼠也是新塔拉萨维奇立克次体的宿主。此外，该地区的蜱是否也携带该立克次体和当地人群中是否存在斑点热感染值得进一步研究。

恙虫病东方体是我国广泛分布的重要人兽共患病病原，其自然界储存宿主主要为鼠类动物，恙螨为其传播媒介[32]。1998年廖如桂等利用间接免疫荧光法确诊了江西首例恙虫病病例，随后赣州、抚州等市县也有恙虫病散发病例报告[33]，2006-2018年江西省部分县市恙虫病的年均发病率超过了0.98/10万[34]。本次调查在江西省浮梁县和南丰县的黑线姬鼠中检出恙虫病东方体，系统进化树显示这2株恙虫病东方体均属Gilliam型，该型是我国主要的流行株，提示这两个县存在恙虫病的自然疫源地。

江西是一个动植物种类繁多、植被覆盖率高、山清水秀的生态秀丽的省份，世界性分布的立克次体病原体也可在这种自然环境中循环。采用分子生物学方法，调查自然环境中的立克次体的宿主和传播媒介，将发现立克次体病的自然疫源地，将为有效防控人群的立克次体感染提供科学依据。

利益冲突：无