基于18S rRNA基因的芜湖市疟疾病例溯源研究

胡婷婷，刘 淦，王文静，李 磊，李梦珠，杨进孙，孙恩涛，陶香林

疟疾是一种危害性极强的人兽共患性疾病。据世界卫生组织统计，2017年发生2.31亿例疟疾病例，造成41.6万人死亡，2018年发生2.28亿例，造成40.5万人死亡，2018年疫情与2017年基本持平但情况仍不容乐观[1]。各国之间频繁的交流，增加了疟疾向低风险地区传播及药物抗性虫株于全球范围内传播扩散的风险[2]。疟疾溯源有助于追溯药物抗性虫株起源、明确疟疾发源地及传播路径，及时制定应对措施阻断其传播[3]。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)组合、微卫星标记、单倍型网络是目前用于疟疾溯源的常规分子标记。Daniels等[4]曾选择SNP作为分子标记进行溯源，但如何高通量获取这些样本的SNP仍需要测序技术及生物信息学分析方法的优化。微卫星标记的方法相对简便，但各实验室标准未完全统一，故在推广应用上存在限制性[5]。单倍型网络进行溯源时，因频繁的重组，使研究核基因组中单核苷酸多态性单倍型之间的祖先关系变得很复杂。综上，以上方法均存在一定弊端，故选择简便性、特异性的分子标记物用于疟原虫的溯源迫在眉睫。

随着分子生物学研究逐渐深入，发现不同地域间的疟原虫存在表型差异，且越来越多的研究选择通过构建系统发育树研究疟疾的地理起源[6-7]。构建系统发育树的分子标记物有mtDNA、SSU rRNA、18S rRNA等，而18S rRNA基因在确定疟疾病原发源地时，准确性、特异性相较其他溯源分子标记物更有优势：18S rRNA极为保守，常作为靶基因应用于疟原虫基因检测以及真核生物种属之间的亲缘关系比较。鉴于其进化缓慢，18S rRNA基因通常也适用于古老生物的进化分析。原虫的18S rRNA 基因在不同虫种间的变化比原核生物、真菌和动植物间的差异大，可用来确定原虫之间的亲缘关系[8]。18S rRNA基因在疟原虫的各个发育阶段都有表达，据此设计疟原虫种间特异引物相对合理，相对于疟原虫其他标记基因而言，更适合构建系统发育树[9-14]。Snounor、Stephaine等的相关研究证明疟原虫18S rRNA基因是追溯疟原虫地理起源可靠的分子标记物[15-16]。本研究构建疟原虫18S rRNA基因系统发育树，建立基于疟原虫18S rRNA基因系统发育分析的溯源方法，研究疟原虫的地理起源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疟原虫基因序列 收集皖南医学院附属弋矶山医院2018年8月至2019年9月期间4例输入性疟疾患者的血样，收集样本经皖南医学院附属弋矶山医院伦理委员会批准。对血样采取提取、扩增、测序等一系列操作获得基因序列，其余地区基因数据从GenBank中搜集整理。

1.1.2 病历资料 患者一：男，53岁，安徽省芜湖市人，于 2019年9月从非洲回国，因头晕头痛、全身肌肉酸痛等症状到芜湖市弋矶山医院就诊，确诊为疟疾感染。患者二：男，48岁，安徽省芜湖市人，长期于非洲工作，回国后因右上腹持续隐痛到芜湖市弋矶山医院就诊，确诊为疟疾感染。患者三：男，53岁，安徽省芜湖市人，于2019年1月从非洲回国，因发热、头痛等症状到芜湖市弋矶山医院就诊，确诊为疟疾感染。患者四：男，65岁，安徽省南陵县人，在非洲尼日利亚居住4月有余，回国后因不慎摔倒出现大小便失禁、意识模糊症状到芜湖市弋矶山医院就诊，确诊为疟疾感染。

1.1.3 主要试剂和仪器 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根)、磁珠法基因组血液DNA抽提试剂盒(上海生工)、T载体PCR产物克隆试剂盒(上海生工生物有限公司)、小型磁力架(上海生工)、离心机(Eppendorf 5430/R)、EPS-100核酸电泳仪Power Supply(上海天能 Tanon)、PCR扩增仪(Eppendorf)、、通用化学发光、荧光和可见光成像系统 FluorChem FC3(美国 Protein Simple公司)。

1.2 方 法

1.2.1 疟原虫基因提取和扩增 磁珠法基因组血液DNA抽提试剂盒(上海生工)疟原虫基因组DNA提取、内外引物疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增(疟原虫属特异性引物(外)rPLU5、rPLU6、恶性疟原虫种特异性引物(内)rFAL1、rFAL2)。引物序列见表1。巢式PCR扩增反应程序和体系参照朱垚吉等[10]。

表1 疟疾患者血样18S rRNA基因扩增引物序列

1.2.2 基因克隆测序分析 纯化PCR产物、连接纯化产物形成重组质粒，将重组质粒导入DH5α感受态细胞，用含氨苄抗生素的固体培养皿筛选出阳性质粒克隆，采用双脱氧链末端终止法(正反向)测序，于NCBI上进行测序结果BLAST比对分析。

1.2.3 系统发育分析 用于疟疾溯源的18S rRNA基因参比序列从GenBank获取，建树所选的参比序列的地理来源包含亚洲、非洲、北美洲等地区。参比序列与血样测序所得序列采用Clustal X、Edit Sequence软件进行序列分析、编辑及截取。用MEGA X对基因序列进行同源性分析以及系统发育树的构建，进化距离选项选择Maximum Composite Likelihood，根据基因特征选择邻接法(N-J)构建系统发育树，Bootstrap法进行1 000次自举检验。恶性疟原虫株来源及核苷酸序列见表2。

表2 恶性疟原虫株来源及核苷酸序列

2 结 果

2.1 血样标本18S rRNA基因PCR扩增产物 利用合成的引物扩增4份血样的18S rRNA基因，产物长度均为206 bp，经测序和NCBI-BLAST比对，结果显示4例患者均是感染恶性疟原虫。

2.2 测序标本信息 对4份血样PCR扩增产物进行测序后构建系统发育树并分析，结果显示本研究采集的4份疟疾患者血样(序列号：MT991411-MT991414)均为非洲本地感染(见图1)。

“*”表示本实验研究的4份血样所得序列

2.3 基因变异特征 4份恶性疟血样18S rRNA基因双向测序、剪接、拼接得到18S rRNA的靶序列，其余恶性疟地理株序列从 GenBank 中获得。用Clustal X(1.81)软件对这些序列进行排序比较及分析。恶性疟18S rRNA靶序列长度为206 bp，其中A占比31.4%，G占比16.4%，T占比40.4%，C占比11.8%；A+T占比71.8%，C+G占比28.2%，即碱基以A+T较多见，基因变异以颠换碱基数较多见，转换与颠换率为0.6，主要发生在第三碱基位点，见表3。

表3 恶性疟地理株18S rRNA基因碱基对转换、颠换数

2.4 基因同源性及遗传距离 使用MEGA X软件选择Maximum Composite Likelihood法计算同源性及遗传距离，结果如表4所示：来自非洲的恶性疟原虫株与来自亚洲-2的恶性疟原虫株同源性较近、遗传距离较小；非洲与亚洲-1、非洲与北美洲的恶性疟原虫株同源均性较远、遗传距离均较大。

表4 非洲、亚洲、北美洲恶性疟地理株18S rRNA基因序列的同源性及遗传距离比较

2.5 18S rRNA基因系统发育树 N-J法基于18S rRNA基因构建系统发育树，如图1。23个恶性疟原虫株大致分成3大分支：来自亚洲的部分恶性疟原虫株(GenBank登录号为：KT991230、KT991172、KT991186、GU816249)与来自非洲的恶性疟原虫株关系密切，形成一大分支；其余亚洲的恶性疟原虫株形成一大分支，且分布在进化树的外支；来自北美洲的恶性疟原虫株形成另一分支。

在亚洲的恶性疟原虫分离株中我们发现了2种拓扑类型，将其命名为亚洲-1(Asia1)、亚洲-2(Asia2)。在系统发育树中我们发现，亚洲-2与来自非洲的恶性疟原虫株聚为一支，推及其同源性及遗传距离，可以看出亚洲-2与非洲的同源性近、遗传距离小；相反地，亚洲-1与亚洲-2的同源性较远、遗传距离大。

3 讨 论

疟疾是疟原虫感染导致的传染病，主要为按蚊叮咬传播，少数为输血传播，存在高、低风险区交互传播风险[15-16]。疟疾溯源对于追溯疟疾发源地或者追溯药物抗性虫株起源及传播路径的相关技术研究十分重要。

本研究基于疟原虫18S rRNA基因进行PCR扩增，对扩增结果进行测序分析，构建系统发育树分析疟原虫的地理起源，相对于Moritoshi Iwagami等通过构建单倍型网络分析疟原虫的地理起源而言，操作简单[26-28]。由系统发育树可知，所选4例恶性疟原虫株与系统发育树内非洲的疟原虫株遗传关系较近，聚集在同一亚支，查询患者病历资料后发现实际输入地与发育树展示结果相符。亚洲的恶性疟原虫分离株呈现出2种拓扑类型，说明基因变异和遗传距离可导致同一地区疟原虫株的基因序列呈现出地理聚集差异和不同的空间聚类特征，在系统发育树中并不按照地理聚集[29-30]。北美洲的不同疟原虫株按照地理来源分别聚集在相同的进化亚支内。以上证明，疟原虫种群会根据地理位置分成不同的亚群，且人类活动会影响种群的分配，即根据该特性构建系统发育树来判断疟疾地理起源具有可行性[31]。以上结果表明18S rRNA基因是进行疟疾溯源研究的准确性、特异性的分子标记。未来可通过18S rRNA 的全基因测序进行系统发育分析，深入研究18S rRNA作为分子标记来判定疟疾是本地还是外地输入性的实用性。系统发育分析能够快速准确地定位感染的地理来源，是确定输入性疫情来源的有价值的公共卫生工具[32-33]。

利益冲突：无