甘肃黄鼠疫源地鼠疫宿主动物致病性耶尔森菌调查分析

徐大琴，席进孝，段 然，景怀琦，春 花，黄燕妍，王 利，张 晨，戎宾国，展东辉，冯甲贵，师占文，安君胜

甘肃阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地是甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地的西南部分，地处甘肃省东北部，包括白银市的会宁县和平川区，疫源面积6 836.9 km2。会宁县于1962年发生新中国成立以来最严重的1起肺鼠疫，发病26例，死亡11例，1963年从阿拉善黄鼠及其寄生蚤体内检出鼠疫菌，判定为阿拉善黄鼠鼠疫疫源地。监测资料显示，会宁县自1963年检出最后1株鼠疫菌后，至今再未检出过鼠疫菌，仅于1974-1979年间共检出91份阳性血清，后于1997年检出1份阳性血清后，再未检出过阳性血清，动物间鼠疫疫情呈现“静息状态”。平川区自1977年自阿拉善黄鼠及其寄生蚤方形黄鼠蚤蒙古亚种检出3株鼠疫菌后，判定为阿拉善黄鼠鼠疫疫源地，以后的监测一直未检出鼠疫菌，并自1984年检出16份阳性血清后，再未检出阳性血清，动物间鼠疫疫情呈现“静息状态”。阿拉善黄鼠是该疫源地的主要宿主，也是优势种，花鼠、达乌尔鼠兔、小家鼠、中华鼢鼠、子午沙鼠等也均有分布[1]。为了解该鼠疫源地内鼠疫宿主动物致病性耶尔森菌感染状况，探索该疫源地鼠疫流行状态，我们做了以下调查。

1 材料和方法

1.1 标本来源 2016-2018年间采集历史疫区会宁县刘寨乡，平川区种田乡，复兴乡鼠疫宿主动物阿拉善黄鼠及花鼠、大仓鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中华鼢鼠、小灰鼠、达乌尔鼠兔、小家鼠、灰仓鼠回盲部及内容物、咽拭子或舌根部、血液标本。

1.2 主要仪器设备及试剂 生物安全柜(SG403-INT型、The Baker Company)、PCR仪为德国senso梯度PCR仪LabCycler Standard plus型，台式高速离心机为德国Eppendorf公司Eppendorf centrifuge5415D，电泳仪(DYY-C6型，北京六一仪器厂)，凝胶成像仪为美国伯乐(Bio-Rad公司)GEL Doc2000。改良磷酸盐缓冲液(PBS)(购自Fluka, peptone sorbitol bile broth),脑心浸液培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司)，耶尔森菌选择性培养基(购自OXOID, Yersinia selective agar base)Api20E生化鉴定条(购自法国生物梅里埃公司 bioMérieux)细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)(购自天根生化北京有限公司)，PCR扩增用Premix Tap酶(Version 2.0 plus dye)、2 000 bp DNA Ladder(DL2000)购自TaKaRa公司。琼脂糖为BioWest公司，分型血清购自日本生研株式会社。间接血凝检测试剂盒(购自兰州生物制品研究所)(批号：20160201,20170401,20181101)。

1.3 菌株分离及鉴定 参照文献[2-3]方法将4 ℃改良磷酸盐缓冲液(PBS)冷增菌20 d后的标本分别接种于耶尔森菌选择性培养基(CIN)平板上及进行标本核酸的提取。将划线接种好的CIN平板置25 ℃培养48 h，选择可疑菌落接种于脑心浸液培养基，25 ℃培养24 h后用接种针挑起菌落至悬浮基物中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，参照Api20E肠杆菌鉴定系统说明书接种于生化鉴定条，在28 ℃恒温培养箱中培养18～24 h后判读结果[4]。

1.4 PCR初筛 提取的标本核酸进行ail、foxA、Inv、Caf1基因的PCR初筛。

PCR扩增体系：premix12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL，纯水10.5 μL，模板1 μL。

PCR扩增参数：95 ℃预变性5 min, 94 ℃变性15 s、57 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,25个循环，72 ℃延伸5 min。扩增结束后于1.5%琼脂糖凝胶(加入Goldview染料，浓度为5 μL/100 mL)电泳，判定结果,阳性结果判定同文献[5]。

1.5 菌株毒力鉴定及鼠血清F1抗体测定 PCR结果阳性与Api20E结果鉴定一致的标本分离出的菌株进行毒力基因检测，主要包括ail、耐热性肠毒素A基因(ystA)、耐热性肠毒素B基因(ystB)、黏附素基因(yadA)、转化活化因子(virF)及rfbc[6]参考文献[7]方法采集和处理鼠类血清，并按照鼠疫菌F1抗体间接血凝检测试剂盒说明书检测F1抗体，判定标准参照《鼠疫诊断标准WS279-2008》。

2 结 果

2.1 标本采集及菌株分离结果 2016-2018年间，会宁县和平川区采集的鼠疫宿主动物舌根部、回盲部及内容物标本数和菌株分离鉴定情况详见表1。

表1 2016-2018年采集标本来源及菌株分离鉴定结果

2.2 菌株毒力基因检测 自花鼠回盲部及内容物检出的1株小肠结肠炎耶尔森菌为非致病性菌株，其毒力型别为(ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-)。

2.3 血清F1抗体检测 鼠疫间接血凝试验方法(IHA)检测阿拉善黄鼠血清312份，鼠疫F1抗体结果均为阴性。

3 讨 论

由于3种致病性耶尔森菌之间存在相互拮抗作用，同一疫源地内的动物感染了某一种致病性耶尔森菌，就不会感染其他种致病性耶尔森菌[8]。会宁县1962-2019年间有2次动物间鼠疫流行，1962-1963年共检出鼠疫菌16株，分离地点均在刘寨乡[9]，且目前鼠疫流行状态呈“静息”[10]。会宁县在1963年从黄鼠及其寄生蚤体内检出鼠疫菌后至今再未检出鼠疫菌，自1974年被动血凝试验用于动物病的诊断后，共检出阳性血清92份，1997年检出1份阳性血清后，至今再未检出阳性血清；平川区自1977年检出3株鼠疫菌后，一直未检出鼠疫菌，1982年检出6份阳性，最高滴度为1∶40，1984年检出16份阳性，最高滴度为1∶80，后再未检出阳性血清。然而与会宁县、平川区相邻的宁夏西吉县、海原县分别于2003年、2004年检出10份、3份阳性血清[10]，推断该疫源地局部地区有鼠疫动物病间断性微弱流行，鼠疫菌有可能以非典型变异的方式保存。本次调查通过了解该疫源地内鼠疫宿主动物致病性耶尔森菌感染状况，探索该疫源地鼠疫流行状态。有研究表明[11]该疫源地先后发现18种啮齿动物，隶属2目7科11属18种，其中阿拉善黄鼠为优势种。本次调查共采集到10种啮齿动物标本(阿拉善黄鼠、花鼠、大仓鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中华鼢鼠、小灰鼠、达乌尔鼠兔、小家鼠、灰仓鼠)，仅在花鼠的回盲部及内容物标本中检出1株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌，这与张涛等研究[12]阿拉善黄鼠检出率低，回盲部及内容物标本小肠结肠炎耶尔森菌检出率高结果一致。本次调查因采集样本量少，无法分析自同一只花鼠的回盲部及内容物标本检出菌，而舌根部标本却未检出菌，我们将做进一步的调查分析。本次调查均在春夏季进行，检菌率低(0.1%)，小家鼠的小肠结肠炎耶尔森检菌率高，可达13.9%[12]，本次调查只捕获一只小家鼠，我们将做进一步调查。据查证，会宁县1962-2019年间有2次动物间鼠疫流行，1962-1963年分别自阿拉善黄鼠体内共检出鼠疫菌5株，分离地点均在刘寨乡。本次调查结果会宁县自刘寨乡检出的1株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌，其毒力型别为(ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-)，这与检出鼠疫菌乡镇一致，这虽然不足以说明与段然等研究[13]结果检出自鼠疫疫源地啮齿类动物的小肠结肠炎耶尔森菌不致病一致，但为进一步研究提供了线索。本次调查小肠结肠炎耶尔森菌检出率低仅为0.1%，未检出假结核耶尔森菌，且312份阿拉善黄鼠血清F1抗体结果均为阴性，结合王梦迪等研究[14]结果推测该疫源地鼠疫菌可能以动物宿主、媒介蚤、生态因子、生态环境等方式保存下来，以现在的监测手段很难发现动物间鼠疫的流行。甘肃黄鼠疫源地黄鼠平均密度自1963以来，呈现逐渐下降趋势，其中1963-1981年间黄鼠平均密度为1.29只/hm2，1982-2019年间黄鼠平均密度为0.60只/hm2[8]。黄鼠密度下降的原因与90年代开垦荒田、兴修水利等和多年来连续灭鼠措施的实施密切相关，既改变了黄鼠最适生存生境，也使黄鼠数量减少，黄鼠分布呈小岛状或点状，媒介蚤类在宿主间的交换机会也相应减少，最终影响鼠疫自然疫源地内由病原、宿主、媒介构成三位体的生态系统，削弱了动物间鼠疫的流行强度[15]。本次调查，虽未能从病原学角度解释该疫源地动物间鼠疫流行状态，但从多年监测分析该疫源地核心地带动物间鼠疫呈现间断性微弱流行，结合其他学者徐丹丹、李瑞的研究结果[16-17]，该疫源地流行状况可能与疫源地动物、媒介、植被、土壤、气象等综合因素相关，我们将进行进一步的研究。

利益冲突：无