基于AMPK/mTOR/Akt途径探究肛门洗剂促进肛瘘大鼠术后创面愈合的机制

吴成成 谢昌营 罗文兵 肖慧荣

1江西中医药大学附属医院肛肠科（南昌330004）；2江西省分宜县中医院肛肠科（江西新余336600）

肛瘘是由于肛周间隙的损伤、感染或是异物等病理因素所形成的与肛周皮肤相通的异常通道，症状主要有局部瘙痒、疼痛、流脓等，在我国，肛瘘的发病率约占所有肛肠疾病的1.7%～3.9%［1］，且复发率较高，对患者的生活带来了很大不便。目前临床治疗肛瘘主要以手术为主，但是由于手术方式是开放式手术，创口易被粪便污染，通常不进行缝合，因此，减轻肛瘘术后创面的炎性反应，缓解患者的疼痛，促进创面愈合对于肛瘘术后恢复至关重要［2］。肛门洗剂是在五倍子汤的基础上发展而来，具有清热解毒消肿、燥湿止痒止血的功效，在肛瘘、混合痔等术后广泛应用，疗效确切［3-4］。本研究通过观察肛门洗剂对肛瘘创面修复的影响，探讨肛门洗剂可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物40 只SPF 健康SD 大鼠，体质量200～220 g，雌雄各半，购于长沙天勤生物科技公司，动物许可证号：SCXK（湘）2018⁃0012。

1.2 药物与试剂肛门洗剂（江西中医药大学附属医院，20190604）；高锰酸钾（正大丰海药业，JS030516）；血管生长因子（vascular growthrelated factors，VEGF）、促血管生成素⁃Ⅰ（angiopoietin⁃Ⅰ，Ang⁃Ⅰ）、促血管生成素⁃Ⅱ（angiopoietin⁃Ⅱ，Ang⁃Ⅱ）；白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β），白介素⁃2（interleukin⁃2，IL⁃2）ELISA 试剂盒（中国欣博盛）；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA 试剂盒（Assay 公司）；逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、mTOR、Akt、GAPDH 抗体，美国Proteintech 公司；BCA 蛋白定量试剂盒，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 主要仪器低温高速离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；X73 型倒置荧光显微镜，日本OLYMOUS 公司；超声匀浆器，日本SANYO 公司；凝胶成像系统，美国BIO⁃RAD 公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及模型制备40 只SD 大鼠随机分为正常对照组、模型组、肛门洗剂组和阳性对照组，每组10 只。除正常对照组外，其余三组参照王琛等［5］方法制作肛瘘术后创面模型。操作过程为：大鼠腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，背部手术区备皮，碘伏消毒，于颈后2.5 cm、脊柱旁侧0.5 cm 处用创伤器做一圆形切口，直径约1 cm，深达肌层，另在尾骨旁1.5 cm 处再做一相同大小的切口，止血后用弯钳从一切口入，钝性分离至另一切口出，引入凡士林纱条，沿纱条注入2 mL 粪水，圆针缝合切口处皮肤，包扎，45 d 后解除，局部超声检查及X 线造影显示均有瘘管形成。

1.4.2 给药方法正常对照组不给药；模型组：用100 mL 生理盐水擦洗创面10 min，纱布包扎，每日2 次；肛门洗剂组：1 包肛门洗剂稀释4 倍，取100 mL 擦洗创面10 min，纱布包扎，每日2 次；阳性对照组：高锰酸稀释5 000 倍，取100 mL 擦洗创面10 min，纱布包扎，每日2 次；连续给药2 周。

1.5 检测指标

1.5.1 创面愈合率参照潘友珍等［6］方法测量创伤面积，并计算创面愈合率。

1.5.2 检测创面肉芽组织Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF、PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达给药结束后，取大鼠创面肉芽组织，低温研磨，加入2 mL 裂解液匀浆，ELISA 法检测Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF、PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达，具体操作严格按照说明书步骤进行。

1.5.3 HE 常规染色观察病理改变给药结束后，取大鼠创面组织，10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE 染色，观察大鼠创面组织病理改变。

1.5.4 RT⁃PCR 法测定创面肉芽组织AMPK、mTOR、Akt mRNA 表达按照试剂盒说明书提取胃组织总RNA，照逆转录试剂盒进行逆转录反应。RT⁃PCR 引物序列见表1。PCR 反应条件：95 ℃45 s，95 ℃15 s，60 ℃40 s，进行45 个循环。每组进行3 次测定，取平均值，图像分析仪扫描凝胶密度，采用2⁃△△CT法计算mRNA 表达水平。

表1 RT⁃PCR 引物序列表Tab.1 Primer sequence table for RT⁃PCR

1.5.5 Western blot 检测创面肉芽组织AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达低温取创面肉芽组织，冷研磨后加入细胞裂解液，在4 ℃、2 000 r/min 离心15 min，BCA 蛋白定量法测定上清液蛋白浓度，取待测样品100 μg，SDS⁃PAGE 电泳，转膜，封闭，加入一抗AMPK（1∶1 000）、mTOR（1∶500）、Akt（1∶500）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育2 h，TBST 洗涤，ECL 显影并扫描。

1.6 统计学方法数据统计分析采用SPSS 17.0软件包，计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肛门洗剂对肛瘘大鼠创面愈合率的影响肛门洗剂组、阳性对照组大鼠的创面愈合率较模型组大鼠明显提高（P＜0.05）。见表2。

表2 肛门洗剂对肛瘘大鼠创面愈合率的影响Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

表2 肛门洗剂对肛瘘大鼠创面愈合率的影响Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

注：与模型组比较，#P ＜0.05

组别模型组肛门洗剂组阳性对照组创面愈合率11.82±1.25 66.95±7.16#50.13±4.38#

2.2 肛门洗剂对肛瘘大鼠VEGF、Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠的Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF 表达明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠的Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF 表达明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 肛门洗剂对肛瘘大鼠VEGF、Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ表达的影响Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang⁃Ⅰ，Ang⁃Ⅱin anal fistula rats ±s

表3 肛门洗剂对肛瘘大鼠VEGF、Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ表达的影响Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang⁃Ⅰ，Ang⁃Ⅱin anal fistula rats ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05

组别正常对照组模型组肛门洗剂组阳性对照组VEGF（ng/L）264.09±28.4 124.59±9.92*197.34±28.75#173.79±12.71#Ang-Ⅰ（μg/L）15.96±2.31 6.41±0.53*13.52±1.14#12.88±2.07#Ang-Ⅱ（μg/L）1.71±0.11 0.95±0.07*1.54±0.12#1.43±0.13#

2.3 肛门洗剂对肛瘘大鼠PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠IL⁃1β、IL⁃2、PGE2 表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠的IL⁃1β、IL⁃2、PGE2 表达明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 肛门洗剂对肛瘘大鼠PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达的影响Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL⁃1β，IL⁃2 in anal fistula rats ±s

表4 肛门洗剂对肛瘘大鼠PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达的影响Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL⁃1β，IL⁃2 in anal fistula rats ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05

组别正常对照组模型组肛门洗剂组阳性对照组IL⁃1β（pg/mL）84.97±7.65 198.08±21.36*104.30±9.58#126.89±14.24#IL⁃2（pg/mL）115.72±12.79 238.21±20.85*123.83±11.93#157.93±15.27#PGE2（pg/mL）87.49±7.75 426.91±33.96*136.99±14.71#166.75±15.66#

2.4 HE 常规染色观察病理改变模型组大鼠创面表层出现明显出血及坏死，组织高度水肿，伴大量炎性细胞浸润，成纤维细胞分布散乱稀疏，未见新生毛细血管。肛门洗剂组、阳性对照组有新生表皮爬覆，炎性浸润明显减少，成纤维细胞成熟且分布整齐，胶原纤维致密且排列整齐，可见新生毛细血管分布。见图1。

图1 创面组织病理形态（HE，×200）Fig.1 Histopathological morphology of the wound（HE，×200）

2.5 肛门洗剂对肛瘘大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表达明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表达明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 肛门洗剂对肛瘘大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表达的影响Fig.2 Effect of anal lotion on mRNA expression of PGE2，IL⁃1β，IL⁃2 in anal fistula rats

2.6 肛门洗剂对肛瘘大鼠AMPK、mTOR、Akt蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图3。

图3 肛门洗剂对肛瘘大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达的影响Fig.3 Effect of anal lotion on protein expression of PGE2，IL⁃1β，IL⁃2 in anal fistula rats

3 讨论

中医学理论认为肛瘘是由于肛周气血不畅、湿热聚结、邪气留滞所致。虽可通过手术切除，但术后创面局部湿热未尽，加之手术使肛周血脉、经络受损，从而导致创面气血亏虚，后期愈合不良［7-10］。因此，肛瘘术后治疗应坚持清热燥湿、补气活血化瘀的治疗原则。肛门洗剂由五倍子、苦参、白芨、桑寄生、明矾、芒硝、黄柏、荆芥等中药组成，具有燥湿止痒止血、清热解毒消肿的功效，在临床治疗肛瘘、痔等肛周疾病广泛使用，可以有效改善患者临床症状、促进创面愈合［11］。

炎症与创面血液运行是影响肛瘘创面愈合的重要因素［12-13］，所以减轻创面早期炎症反应，促进局部血液循环，对于提高肛瘘术后创口的愈合至关重要［14］。VEGF 是主要的血管生长因子，血管生成可谓创面愈合中的一个关键环节，研究［15］表明慢性伤中VEGF 浓度下调导致的血管生成减少是伤口难愈合的主要原因；Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ已被公认在创伤后病理性血管生成、修复中发挥关键作用［16-17］。PGE2 是重要的炎性介质，在局部发生伤害性刺激时迅速产生，可以激活周围感觉神经末梢的疼痛受体，强化痛感［18］；IL⁃2 可以促进细胞因子的产生，促进抗体分泌和B 细胞增殖，激活巨噬细胞［19］；IL⁃lβ 在急性炎症中起重要作用，可激活巨噬细胞，启动炎症级联反应［20］。本研究发现，在肛瘘模型大鼠中，肉芽组织Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF表达降低，说明大鼠血运不畅，血管生成受损；PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达升高，说明大鼠具有明显的炎症反应；在经过肛门洗剂治疗后，Ang⁃Ⅰ、Ang⁃Ⅱ、VEGF 表达升高，PGE2、IL⁃1β、IL⁃2 表达降低，说明肛门洗剂可以降低肛瘘大鼠创面炎症反应，促进创面新生血管的形成，从而达到加速创口愈合，并可能通过降低PGE2 表达发挥一定的镇痛作用。

AMPK 是调节能量代谢的关键分子，近年来的研究显示AMPK 对炎症反应有一定的抑制作用［21］，活化的AMPK 对多种细胞中促炎因子（IL⁃6、IL⁃1β）的合成及分泌具有抑制作用［22］；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是维持细胞生长、新陈代谢以及血管发生的重要调控元件。在创伤愈合过程中可分泌VEGF、成纤维细胞生长因子（FGF）等多种生长因子，促进创伤愈合［23］。Akt 是PI3K/Akt 信号通路下游重要的靶因子，具有促进细胞生存、抗氧化、抗凋亡等细胞保护功能。研究显示，增加Akt的表达量，可促进神经元存活。本研究对创口新生肉芽组中AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达进行检测，结果显示模型组大鼠创面AMPK、p⁃mTOR、p⁃Akt 蛋白表达明显降低；而经肛门洗剂治疗后，AMPK、mTOR、Akt 蛋白表达明显升高。说明肛门洗剂可通过激活AMPK 蛋白表达抑制创口炎症反应，并可通过增加mTOR、Akt 蛋白的表达促进创口处细胞的生长及增殖，加速伤口的愈合。

综上所述，肛门洗剂可抑制肛瘘大鼠创口炎症反应，促进血管新生及伤口愈合，其可能是通过调控AMPK/mTOR/Akt 信号通路来实现的。