太白通络凝胶膏对兔膝骨关节炎炎性因子及关节软骨的影响

李哲 柳源 李彦民 杨锋，△

膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)又称膝退行性关节炎，是以膝关节软骨破坏及滑膜病变等为主要病变特征的慢性疾病，其中异常炎症反应及关节软骨细胞凋亡是导致关节组织发生退行性变化的重要原因之一[1-2]。相关研究显示[3-7]中医药对膝骨性关节炎的治疗已取得大量成果。然而由于中药成分比较复杂，相关作用机制尚不明确。

太白通络凝胶膏是陕西省名中医李彦民教授的经验方，采用太白山道地“七药”铁牛七30 g、制南星10 g、细辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g等五味药组成并结合现代制剂工艺制成的外用制剂，初步临床研究疗效显著[8-9]。本次研究通过观察太白通络凝胶膏对兔膝骨关节炎模型关节软骨中TGF-β1、MMP-13、Col-Ⅱ及关节液中IL-6、IL-1β及TNF-α表达的影响，来研究太白通络凝胶膏治疗膝骨关节炎的作用机理，为太白通络凝胶膏在临床应用及推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只雌雄各半新西兰白兔，SPF级，3～4个月龄，体质量1.8～2.0 kg(西安易诺谷生物科技有限公司供给，实验动物中心许可证号为SCXK(陕)2017-002)。

1.2 实验药物及试剂

太白通络凝胶膏由铁牛七30 g、制南星10 g、细辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g五味中药组成，由陕西中医药大学药学院制备而成，双氯酚酸二乙胺乳胶剂(北京诺华制药有限公司生产，国药准字H19990291)、苏木精-伊红(HE)及甲苯胺蓝(TB)(百奥莱博生物科技有限公司)、兔IgG-免疫组化试剂盒(博士德生物公司)、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、柠檬酸盐缓冲剂(科昊生物工程有限责任公司)、MMP-13、TGF-β1、Col-Ⅱ试剂盒(Proteintech)。

1.3 实验仪器

外科手术器械(手术剪、手术刀、止血钳、缝合针、组织镊、无菌敷料等)、冰冻切片机(湖北安立信医疗实业有限公司，中国)、生物组织包埋机(天津爱华医疗器械有限公司，中国)、光学显微镜(Leica 仪器有限公司，德国)、恒温水浴锅(常州天瑞仪器有限公司，中国)、高速离心机(杭州奥盛仪器有限公司，中国)。

1.4 方法

1.4.1兔模型制备与处理 将40只新西兰白兔，用随机数字表法分为4组(每组10只)，A组为空白组、B组为模型组、C组为对照组(玻璃酸钠干预组)、D组为实验组(太白通络凝胶膏干预组)。除空白组外，实验组、对照组和模型组3组实验兔均采用改良Hulth法[1]构建兔膝骨关节炎模型。

待造模成功后，对兔右侧下肢关节周围进行脱毛处理，空白组给予同等规格的医用胶布敷贴，实验组、对照组、模型组分别给予太白通络凝胶膏、双氯酚酸二乙胺乳胶剂、医用胶布，1次/d，8 h/次，连续4周。

1.4.2标本制备及观察 在给药结束后，采用空气栓塞法处死4组实验兔。切开关节囊，肉眼仔细观察关节软骨表面的形态变化及软骨厚度、色泽等大体变化。实验兔处死后，在切开兔膝关节之前，实施膝关节穿刺术，在右膝关节周围用碘伏消毒后，首先向关节腔注射1.0 mL玻璃酸钠注射液，充分活动膝关节并抽取关节液，立刻经4 ℃、转速4 500 r/min离心，取其上清液置入-20 ℃冰柜内保存待用。使用ELISA检测关节液IL-6、IL-1β、TNF-α含量。关节液采集完毕后，取3 mm×3 mm、厚约0.5 mm的股骨髁关节面软骨组织，放入10%中性组织固定液中浸泡24 h，清水冲洗后，浸入缓冲液脱钙20 d，再进行脱水、透明、浸蜡、包埋和切片，参考试剂盒说明书染色。

关节液采集完毕后，切开兔右膝关节囊，充分暴露膝关节，观察关节面软骨色泽、光滑度、缺损等大体变化。按Pelletier标准[10]进行评分，在光镜下观察HE染色、TB染色后的切片，观察关节软骨变化，参考Mankin’s评分[11]评估兔膝关节软骨缺损严重程度，评分越高表示软骨缺损程度越严重。用ELISA方法测量关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平。用免疫组化法测量关节软骨中MMP-13、TGF-β1、Col-Ⅱ表达水平，在光镜下观察、摄图，使用Mage-Pro Plus 6.0图像分析软件对图片进行分析，计算视野内所有选定阳性细胞的平均反应强度及平均光密度(AOD)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 影像学观察

实验过程中所有造模动物切口愈合良好，无兔子死亡，新西兰兔模型均单腿跛行。在造模后连续驱赶兔活动4周，随机从各组选出5只兔子行双膝关节正侧位DR。空白组兔双膝关节正侧位DR提示左右膝关节未见畸形，关节面光整，未见骨赘物，关节间隙未见狭窄。模型组、对照组、实验组双膝关节正侧位DR提示右膝关节呈内翻畸形，关节间隙狭窄，关节周围骨赘明显；左膝关节未见明显异常，见图1。

图1 兔膝关节正侧位DR片

2.2 关节软骨改变大体观察

按照Pelletier标准[10]评分结果见表1及图2，空白组大体观察下其右膝关节表面光滑，有弹性，浅蓝色，半透明，无裂纹、缺损及软化；模型组关节软骨表面大多呈黄色，斑片状或广泛性粗糙、糜烂，甚至出现裂纹、缺损及软化，失去弹性；对照组与实验组关节软骨的病理变化肉眼观察基本相同，表面大多呈黄色，斑片状或广泛性略显粗糙，未见裂纹或缺损。

表1 兔膝关节软骨面大体Pelletier评分(例)

图2 兔膝关节大体观察

2.3 软骨切片光镜下组织病理学变化

HE及TB染色结果均显示：A组关节软骨结构完整，表面光滑，轮廓清晰，无裂隙或缺损，四层结构清晰，潮线完整染色后软骨层呈深蓝色，钙化层呈淡蓝色，软骨下骨呈蓝紫色；B组关节软骨层明显缺损、变薄，部分区域软骨全层丧失，切线层严重破坏，呈斑片状或广泛性碎裂或缺失，细胞减少，大量簇聚，潮线破坏；C组关节软骨层次基本完整，切线层不规则，染色不均匀，细胞数量减少，损伤程度明显好于B组，软骨层轻度缺损，部分有裂隙，潮线尚完整；D组关节软骨层，切线层软骨细胞部分缺失，少许表浅裂隙，潮线尚完整，见图3-图4。

图3 兔膝关节软骨观察(HE染色，×10)

图4 兔膝关节软骨观察(TB染色，×10)

从Mankin’s[11]评分表结果显示：各组评分结果比较，差异有统计学意义(P<0.001)；与空白组评分相比较，模型组、对照组、实验组评分差异有统计学意义(P<0.001)；相比于模型组，对照组和实验组评分较低，差异有统计学意义(P<0.001)；但对照组与实验组之间评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组兔右膝关节软骨Mankin’s评分

2.4 关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量检测

模型组、对照组、实验组IL-6浓度与空白组，差异有统计学意义(P<0.001)；对照组、实验组浓度值低于模型组，差异有统计学意义(P<0.001)；实验组与对照组比较，实验组关节液中IL-6含量偏高，但差异无统计学意义(P>0.05)。空白组关节液中IL-1β表达水平明显低于模型组、对照组和实验组，差异有统计学意义(P<0.001)；对照组、实验组浓度值低于模型组，差异有统计学意义(P<0.001)；实验组与对照组比较，实验组关节液中IL-1β含量偏高，但差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、对照组、实验组TNF-α浓度较空白组高，差异有统计学意义(P<0.001)；对照组、实验组浓度值低于模型组，差异有统计学意义(P<0.001)；对照组与实验组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3及图5。

表3 太白通络凝胶膏对兔膝关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α的影响

图5 兔膝关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达

2.5 关节软骨中Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1表达水平

各组软骨组织中Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1的平均光密度比较，差异有统计学意义(P<0.001)；与空白组比较，模型组、对照组和实验组软骨细胞中MMP-13的平均光密度均值明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)；相比于对照组与实验组，模型组MMP-13的平均光密度均值略高，差异有统计学意义(P<0.001)；而实验组与对照组相比差异不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4及图6。

图6 关节软骨Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1细胞因子表达的AOD

表4 关节软骨Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1表达的平均光密度

光镜下观察显示：空白组关节软骨细胞中可见少量MMP-13表达；与空白组比较，对照组和实验组关节软骨细胞中MMP-13呈高表达状态；相比于其他三组，模型组软骨中表达MMP-13的软骨细胞数量最多，见图7。空白组关节软骨细胞中Col-Ⅱ、TGF-β1呈高表达水平；对照组和实验组的软骨细胞中Col-Ⅱ、TGF-β1含量低于空白组，但高于模型组，见图8-图9。

图7 MMP-13免疫组化表达(×40)

图8 TGF-β1免疫组化表达(×40)

图9 Col-Ⅱ免疫组化表达(×40)

3 讨论

膝骨性关节炎(KOA)与外伤、炎症、衰老、代谢和免疫等诸多因素有关，但其确切发病机制尚不明确。近年来越来越多的研究证实，KOA关节软骨细胞外基质合成与降解失衡是造成关节软骨变性的重要原因之一，其中炎性因子及软骨代谢相关细胞因子在骨关节炎发病中发挥着重要作用[12-13]。目前，中医药治疗膝骨性关节炎的主要手段膏药外敷以其简便经济，作用直接、疗效卓著的特点在中医外治法中占有非常重要的地位[14-15]。太白通络凝胶膏以名老中医学术经验为指导，辨证与辨病相结合，参考对骨关节炎中医药研究文献，提出“通络除痹”的中医治疗原则，并根据多年临床经验，自拟太白通络方治疗骨关节炎，全方由太白山道地草药铁牛七30 g、制南星10 g、细辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g五味中药组成。临床应用证实，太白通络凝胶膏对骨关节炎等退行性骨关节疾病临床疗效显著[9]。本研究通过构建膝骨关节炎兔模型，证实了太白通络凝胶膏能够降低兔模型关节液中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平，以起到治疗作用。

骨性关节炎发生的主要细胞病变过程以软骨细胞凋亡为主，其中MMP/TIMP-1动态平衡失调可能起着决定作用[16]。关节软骨在代谢方面MMPs起着重要作用[17]，而MMP-13则是降解胶原的主要酶，其作用最强[18]。上述MMPs不能单独对软骨的破坏起作用，而是相互协同产生作用。MMP-13可裂解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及胶原溶解后初始产物，而关节软骨细胞外基质主要成分之一是Ⅱ型胶原，其次为蛋白聚糖，Ⅱ型胶原遭到降解和破坏后，会导致软骨支架结构的崩塌[19]。TGF-β1促进骨间充质细胞分化为软骨细胞，并促进Ⅰ型胶原、骨基质蛋白、蛋白聚糖等软骨细胞基质主要成分的合成[20]。TGF-β1可以抑制IL-1对软骨细胞外基质中蛋白多糖的分解且抑制MMP的产生，从而阻止MMP对软骨细胞基质的破坏[21-22]。Col-Ⅱ代谢的异常将会造成软骨基质的降解，因此Col-Ⅱ可以作为衡量软骨细胞分化异常和损伤的重要依据。

早期对太白通络凝胶膏的研究以临床疗效研究为主，并未对其具体机制进行系统研究。本实验证明太白通络凝胶膏能够调控兔膝关节软骨组织中凋亡抑制因子MMP-13的表达水平，从而抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子诱导的软骨细胞的凋亡，其抑制作用与太白通络凝胶膏组成方药的主要成分有关。太白通络凝胶膏组成方药为太白山道地药材，其中铁牛七(别名八百棒、雪上一枝蒿、铁棒锤、三转半)为陕西常用道地药材，其性热，味辛、苦，有大毒，具有活血祛瘀、祛风除湿、止痛消肿、兴奋精神、消炎镇痛等功效。天南星味苦辛，性温，归肺、肝、脾经，功能消肿镇痛，燥湿化痰，祛风定惊，消痞散结。细辛具有祛风散寒、止痛通窍、止咳平喘、通利血脉的功效，川牛膝具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋、催产下胎之效。又因川牛膝活血化瘀能力强于怀牛膝，故此方中用川牛膝而非怀牛膝以期获得活血化瘀兼补肝肾的效果。秦椒现多称为花椒，具有除寒湿痹痛、坚齿发、明目之功效，现代药理学研究发现花椒还具有镇痛作用，可能与花椒中所含茵芋碱有关[23]。取铁牛七散寒除湿、祛瘀止痛的作用，是为君药；制南星燥湿化痰、散结消肿为臣药，细辛、秦椒散寒止痛为佐药，川牛膝活血通络、引药直达病所为使药，共奏散寒除湿、通络止痛之功。在临床使用中太白贴膏治疗膝骨关节炎在缓解疼痛、改善膝关节功能、改善中医证候、提高患者生活质量等方面具有明显优势[9]。

本实验结果证明：外敷太白通络凝胶膏治疗兔KOA机理是通过降低关节液中IL-6、IL-1β、TNF-α，减缓关节炎性反应和关节软骨的损伤，并且减少MMP-13表达，促进Col-Ⅱ、TGF-β的分泌，抑制关节软骨细胞的破坏，延缓关节软骨损伤，起到保护软骨细胞的作用，为太白通络凝胶膏在临床应用及推广提供了理论依据及药效学基础。