桂枝附子汤调控TXNIP/NLRP3/caspase-1通路抑制软骨细胞焦亡的机制研究

杨洋，梅胜，辛龙

骨关节炎是最常见的老年慢性疾病之一，随着社会老龄化的加剧和肥胖率的上升，骨关节炎的发病率逐年提高，已经给我国带来了严重的经济负担和社会负担[1]。晚期骨关节炎患者可以进行关节置换手术治疗，然而，由于关节置换术后的功能恢复可能较差，并且假体有一定的寿命限制[2]，因此更多研究的重点转移到骨关节炎的预防和早期治疗。目前有研究提出了骨关节炎相关的发病因素，比如遗传性、衰老、肥胖等，但是骨关节炎的发病机理仍不明确[3]。研究表明，细胞焦亡在骨关节炎的病理过程中发挥着不可忽视的作用[4]。因此，通过药物抑制细胞焦亡可能是一种潜在的治疗骨关节炎方法。我国中医药是治疗骨关节炎的传统手段，具有不良反应小、药效缓及多靶向整体作用等优势[5]，为骨关节炎现代临床的药物治疗提供了新的思路。桂枝附子汤是《伤寒路》中的经典方剂，临床常用于骨关节炎的治疗，但其具体作用机制尚不明确[6]。因此，本研究通过探究桂枝附子汤调控TXNIP/NLRP3/caspase-1通路抑制软骨细胞细胞焦亡的作用机制，以期为桂枝附子汤治疗骨关节炎的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 试剂 桂枝附子汤由浙江省立同德医院提供；软骨细胞由浙江省骨骼肌肉退变与再生修复转化研究重点实验室提供；DMEM/高糖培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自德国Serana公司；MTT试剂盒购自上海MCE公司；LDH试剂盒、Hoechst/PI染色购武汉巴菲尔生物科技有限公司；TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1和-actin购自上海abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 桂枝附子汤制备与质控 桂枝附子汤由桂枝12 g、附子15 g、生姜9 g、红枣12枚及甘草6 g组成，全方水煎，浓缩去渣。以HPLC制备全方指纹图谱，分别用各味药对照品进行定性定量分析，建立质量控制标准。

1.2.2 软骨细胞培养 软骨细胞用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的DMEM/高糖培养基培养，并置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.3 MTT检测细胞活性 取5×104的细胞接种至96孔板中，分别用0、10、20、50、100及200mol/L浓度的桂枝附子汤干预软骨细胞48h。每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，避光培养4 h；弃上清，每孔加入150l DMSO溶液，震荡10 min，自动酶标读数仪比色，测定其吸光值（波长490 nm），计算各组软骨细胞活性。以未进行干预的软骨细胞为对照组，使用不同浓度枝附子汤溶液干预的软骨细胞为试验组。细胞活性（%）＝实验组吸光值/对照组吸光度均值×100%。

1.2.4 OGD/R模型建立软骨细胞 用Earle's平衡盐溶液培养，置于37℃，1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱中培养12 h，然后用DMEM/高糖培养基培养，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24 h。

1.2.5 细胞分组 将软骨细胞分为对照组、OGD/R组、低剂量桂枝附子汤组（10mol/L）、高剂量桂枝附子汤组（100mol/L）进行研究分组。

1.2.6 微量酶标法检测软骨细胞LDH释放量 各组软骨细胞接种于96孔板，进行相应干预后。加入60l LDH检测液混匀，在避光条件下摇床孵育30 min。将细胞培养板用多孔板离心机1 600 r/min离心5 min。分别取各孔的上清液120l，加入到新的96孔板相应孔中，酶标仪检测各孔的吸光度（波长490 nm）。分别测定OGD/R组、低剂量桂枝附子汤组、高剂量桂枝附子汤组软骨细胞LDH相对释放量。LDH释放量=实验组吸光值/对照组吸光度均值。

1.2.7 Hoechst33342/PI染色法检测软骨细胞细胞焦亡 将细胞培养于6孔板中，分别对各组细胞进行干预。PBS洗涤3次，将Hoechst33342溶液、PI溶液和细胞染色缓冲液以1∶1∶200比例混匀形成工作液，每孔加入1 ml工作液，4°C避光反应30 min，PBS洗涤3次后荧光显微镜下观察各组软骨细胞焦亡情况。

1.2.8 RT-PCR检测软骨细胞mRNA表达 按Trizol试剂盒说明书进行，在20l反应体积中进行。42℃固定浴60 min，99℃固定浴5 min，－20℃保存备用。引物扩增设计：根据Genebank序列，设计各个引物序列并合成，引物序列见表1。使用SYRB Premix ExTaqTM和ABI 7900扩增仪进行荧光扩增；分析计算CT值，检测各组软骨细胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA的表达水平。

表1 PCR引物序列

1.2.9 Western Blotting法检测软骨细胞蛋白表达提取软骨细胞蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜。在TBS-T液内清洗，加5%脱脂奶粉，37℃封闭1h。封闭结束后，用TBS-T稀释3次，并置于TBS-T 4℃震荡过夜。TBS-T液漂洗PVDF膜3次，将膜与TBS-T稀释二抗孵育，室温下振荡1h；TBST漂洗PVDF膜3次，随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表达水平。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以均值±标准差表示，采用单因素方差分析和独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度桂枝附子汤对软骨细胞活性的影响10、20、50及100mol/L桂枝附子汤处理后，软骨细胞活性较0mol/L差异均无统计学意义（均P＞0.05），200mol/L桂枝附子汤能明显降低软骨细胞活性（P＜0.05）。见表2。

表2 不同浓度桂枝附子汤对软骨细胞活性的影响

2.2 桂枝附子汤降低软骨细胞LDH释放量 OGD/R组软骨细胞LDH释放量较对照组显著升高（P＜0.05），而低剂量桂枝附子汤组和高剂量桂枝附子汤组软骨细胞的LDH释放量较OGD/R组均明显降低（均P＜0.05）。见表3。

表3 桂枝附子汤对软骨细胞LDH释放量的影响

2.3 桂枝附子汤降低PI阳性软骨细胞数量 与对照组相比，OGD/R组PI阳性软骨细胞数明显上升（P＜0.05），而经不同浓度桂枝附子汤处理后，PI阳性软骨细胞数较OGD/R组显著降低（P＜0.05）。见封二彩图1和表4。

表4 桂枝附子汤对软骨细胞细胞焦亡的影响

2.4 桂枝附子汤抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA的表达 与对照组相比，OGD/R组软骨细胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA表达显著升高（均P＜0.05）；而低剂量桂枝附子汤组和高剂量桂枝附子汤组软骨细胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA表达较OGD/R组显著降低（均P＜0.05）。见表5。

表5 桂枝附子汤对软骨细胞mRNA表达的影响

2.5 桂枝附子汤抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白水平的表达 与对照组相比，OGD/R组软骨细胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表达显著升高（均P＜0.05）；而经不同浓度桂枝附子汤处理后，TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表达明显降低（均P＜0.05）。见封二彩图2、表6。

3 讨论

骨关节炎一种常见的高致残率、低治愈率的慢性关节疾病，主要病变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生[1]。目前，临床上常用于治疗骨关节炎的药物有阿片类镇痛药、非甾体类抗炎药、甾体类抗炎药及解热镇痛药等[7]。然而尽管这类药物能缓解骨关节炎疼痛症状，但无法减缓骨关节炎的退变进程[8]。

中医药是我国治疗骨关节病的传统手段，具有不良反应小、药效缓和、多靶向整体作用等优势[5]。骨关节炎常以关节疼痛、胶着为主要临床表现，属于痹证中营卫不和、寒湿阻痹证的范畴[9]。桂枝附子汤包含桂枝、附子、生姜、红枣及甘草成分，具有祛湿通络、温经通阳、调和营卫、补益肝肾及活血化瘀等作用[10]。然而由于中医药方和骨关节炎病理的复杂性，桂枝附子汤治疗骨关节病的具体机理尚未明确阐明。本实验通过探究TXNIP/NLRP3/caspase-1通路，表明桂枝附子汤可以抑制软骨细胞细胞焦亡，这可能是桂枝附子汤治疗骨关节炎的机制之一。有趣的是，笔者发现小剂量（10、20mol/L）的桂枝附子汤可以增加软骨细胞活性，这表明桂枝附子汤中有成分能促进软骨细胞增殖，然而高剂量的桂枝附子汤却抑制软骨细胞活性，这可能是高浓度药物的毒副作用导致的。

炎症和细胞死亡是骨关节炎的两个主要特性[11]。细胞焦亡是近年来被证实的一种伴随炎症发生的程序性细胞死亡方式。有研究表明，细胞焦亡在骨关节炎的病理过程中发挥着至关重要的作用[6]。TXNIP/NLRP3/caspse-1通路是细胞焦亡的一条重要通路[12]。在骨关节炎氧化应激的条件下，TXNIP将被激活，从胞核转位到胞质，结合并激活NLRP3受体，促进NLRP3炎性小体的形成。NLRP3炎性小体是由NLRP3、pro-caspase-1和凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）所组成的蛋白复合物，能进一步激活caspse-1。活化的caspase-1诱导IL-1成熟、释放，募集炎症细胞聚集，诱发级联放大的炎症反应[13]。本研究通过ODG/R方法建立软骨细胞焦亡模型，分别用10、20mol/L的桂枝附子汤处理软骨细胞后，LDH 释放试验和Hoechst33342/PI染色法均证明桂枝附子汤能抑制软骨细胞细胞焦亡。此外，RT-PCR和westernblot结果进一步表明桂枝附子汤能通过调节TXNIP/NLRP3/caspse-1通路抑制细胞焦亡。

综上所述，桂枝附子汤能调控TXNIP/NLRP3/caspase-1通路抑制软骨细胞焦亡，为临床上桂枝附子汤治疗骨关节炎提供了理论依据。