人工养殖林麝脓肿病病原菌的分离与鉴定

吴世洲 杨林富 钱丽敏 杨明华 李琦华 陈培富*

(1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明，650201)

林麝(Moschusberezovskii)属于国家一级重点保护野生动物，也是用于生产麝香的主要物种，其饲养价值较高，每头成年麝价格3—5万元人民币。作为一种小型野生反刍动物，林麝的人工驯养难度较大，尤其因脓肿病引起的死亡颇多，已成为制约林麝养殖发展的重要因素。该病一年四季在各年龄段都会发生，尽管多数呈零星发生，但治愈率低，死亡率高达50%[1]。林麝的脓肿病可分为皮下脓肿和内脏脓肿两类。皮下脓肿多见于颈部，也见于头和四肢，用手可触摸到，较大的脓肿肉眼就能观察到。内脏脓肿集中发生于肝脏，往往在林麝病死后剖检才会发现。患病林麝表现为不采食、消化不良、发烧和精神沉郁，如未及时救治，因脓肿病逐渐加重，一两周内就会死亡。据报道，引起林麝脓肿的主要病原有大肠杆菌(Escherichiacoli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes，旧称化脓棒状杆菌Corynebacteriumpyogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和葡萄球菌(Staphylococcusspp.)[2-6]，但临床用药的防治效果相当有限，推测可能与人工养殖林麝个体的抗病力普遍较低和病原菌携带多种毒力及耐药基因有关。滇西某林麝养殖场自陕西某地引种数年以来，深受该病困扰。由于林麝生性容易受惊，不便捕捉观察，即便患脓肿病也不易发现，多数病麝发展至重症才被发现，以致死亡率居高不下，因此有必要尽快确定脓肿发生的病因并设法控制该病。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康和患脓肿病林麝各4头，饲养于滇西某林麝养殖场(海拔2 430 m，年均气温10℃)。圈舍与生活区相距3 m。对该种群采取自然交配繁育，饲料主要由山泉水浸泡过夜的包谷、临时切成碎片的南瓜块和购入的新鲜桑叶枝条组成。细菌基因组DNA提取试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司，DH5α感受态大肠杆菌细胞购自北京全式金生物技术有限公司，pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。含体积分数5%的脱纤维蛋白抗凝绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)为自行配制。

1.2 样品采集

采集样品前，观察病死林麝的临床表现和病理剖检变化。使用一次性灭菌注射器，对存活林麝采集外周循环血液，病死个体则采集心脏内尚未凝固血液；一份保存于加肝素钠的采血管，另一份保存于不加肝素钠的采血管，5 h内送检血液生理生化指标。无菌采集患皮下脓肿病林麝(3头)的脓肿组织和死于肝脓肿病林麝(1头)的肝脏内部组织，用于分离培养病原菌。

1.3 病理显微观察

由武汉赛维尔生物技术公司按常规方法制作病麝肝脏病理切片，镜检组织细胞形态变化。

1.4 细菌分离培养及生化、药敏试验

取少许脓汁，均匀涂布于绵羊血琼脂，放置恒温箱中37℃培养18—24 h，观察菌落形态。选取不同形态特征的单菌落，划线接种继续培养，直至获得纯培养物。取纯培养物转种于LB液体培养基，37℃恒温水浴摇荡培养18—24 h，取部分菌液，按V(菌液)∶V(体积分数50%的灭菌甘油)=1∶1的比例充分混匀，于冰箱中-80℃保存备用。将纯培养物分别接种于麦康凯琼脂和LB琼脂，37℃培养18—24 h，随后做革兰染色镜检、生化(甲基红、乙二酰、乳糖等)试验和药物(氨苄西林等13 种抗生素)敏感试验。对应每个病例各取1个菌落代表菌株用于后续的试验研究。

1.5 分离菌株的16S rRNA基因扩增分析

提取菌液DNA，使用细菌16S rRNA通用引物[7]做PCR扩增。反应体系(50 μL)为ddH2O 23μL、Mix 23 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL；扩增程序为95℃预变性5 min；94℃变性50 s、52℃退火45 s、72℃延伸50 s，35个循环；72℃再延伸10 min。经质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检查符合预期大小的PCR产物，回收纯化，插入pMD19-T载体，转化感受态大肠杆菌细胞，从含氨苄西林的LB琼脂培养得到阳性细菌克隆，送上海生物工程有限公司测序，所获核酸序列利用Blast做在线比对分析。

1.6 毒力基因和耐药基因PCR扩增检测

参照文献报道合成引物，包括肠外致病性大肠杆菌特征基因ompA和毒力基因[8-9]、黏质沙雷菌毒力基因引物[10]及耐药基因引物[11-14](表1)，均由昆明擎科生物公司合成。PCR扩增30个循环，除退火温度设置对不同基因有差异外，其他均按常规程序操作。PCR扩增条带经TA克隆及DNA测序验证。

表1 大肠杆菌和黏质沙雷菌的PCR引物

1.7 数据分析与处理

应用DNAstar软件对分离菌株的核酸序列做同源性分析及系统发育树构建；生理生化指标用“平均值±标准差”表示，组间数值差异用SPSS 20.0软件做配对t检验。

2 结果与分析

2.1 临床及病理检查情况

患病林麝体温升至41℃左右，按该养殖场常用治疗方法，取青霉素和链霉素做肌肉注射。脓肿发生于内脏的林麝，死后才被发现，其身体消瘦，胃内容物酸臭，胃黏膜溃烂；脓肿发生在肘关节的林麝，表现为不愿站立，强制驱赶让其踱步时，患肢提起，不愿落地，表现痛苦；颈部尤其在下颌处发生脓肿的林麝，脓肿可大似鸡蛋，进食速度较慢，吞咽食物困难，日渐消瘦，被及时发现并做脓肿切开术排脓处理的可存活。剖检体表未见脓肿的死亡林麝，可见其肝脏大面积发生脓肿，其他内脏器官无肉眼可见病变。进一步镜检肝组织切片，可见肝细胞发生大面积干酪样坏死，结缔组织层包裹坏死灶且有大量炎性细胞浸润(图1)。

2.2 血液生化指标差异

患病组与健康组血清天门冬氨基酸转移酶(AST)活性分别为(447.25±33.64)、(305.50±14.71)U/L，组间存在显著差异(P<0.05)，指示患病个体肝功能受损明显，但未见其他指标存在显著差异。

2.3 细菌分离鉴定

2.3.1 脓肿来源菌株的基本特性

从肝脓肿只分离得到1种细菌纯培养物，记作A样菌株，其在绵羊血琼脂、麦康凯琼脂和LB琼脂表面形成的菌落颜色分别为乳白色、粉红色和白色，生化试验结果显示其符合大肠杆菌的基本特性。从3头病麝皮下脓肿分别只分离得到1种(3株)细菌纯培养物，记作B样菌株，其在绵羊血琼脂和LB琼脂形成的菌落均为单纯乳白色，但在麦康凯琼脂形成淡黄色菌落，其生化特性符合黏质沙雷菌。A样和B样菌株均对青霉素和氨苄西林耐药，对头孢曲松、头孢噻肟、卡那霉素、新霉素、恩诺沙星、环丙沙星、痢特灵和氟苯尼考表现为中度或高度敏感。但与B样菌株相比，A样菌株还对链霉素、庆大霉素和大观霉素耐药。

2.3.2 基因扩增

对分离菌株16S rRNA基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳得到约1 500 bp的单一条带。重组pMD19-T质粒经PCR扩增检查，产物条带符合预期大小。在线Blast分析显示，A样菌株16S rRNA序列与大肠杆菌多个参考菌株的相似性在99%以上，B样菌株包括分离株1、2、3，其GenBank登录号分别为MT131168、MT131169和MT131170，与黏质沙雷菌参考菌株KC206270的相似性达99%以上，但与沙雷菌属内其他种的序列不聚在同一分支(图2)。由此可判定A样菌株为大肠杆菌，B样菌株为黏质沙雷菌。

进一步对大肠杆菌分离株进行10种毒力基因检测，检测出肠外致病性菌株相关的外膜蛋白基因(ompA)(图3)，未检出其他的黏附素类(afa/draB、iha、sfa/focCD)、铁转运系统类(sitDep.a、sitDchr.、iucDa)、血清类(neuC)和毒素类(sat、vat)基因。在黏质沙雷菌分离株中，4种公认的毒素类基因(pHlA、swr、shlA、shlB)均被检测到(图4)，表明其有致病性。

3 讨论

基于TSA的血琼脂是适合从临床样本分离病原菌的常用培养基。本研究使用该培养基从人工养殖林麝脓肿组织内部分离到黏质沙雷菌和大肠杆菌，表明这2种细菌是引起该养殖场林麝脓肿的直接病原菌。大肠杆菌多数是肠道正常菌群的组成部分，但某些血清型的大肠杆菌对人和动物具有致病性，并且有肠道致病性和肠外致病性大肠杆菌之分。本研究从死亡林麝肝脓肿组织分离到大肠杆菌，并检测到肠外致病性大肠杆菌的特征基因ompA，但未检测到其他毒力基因，提示该大肠杆菌分离株属于低毒力或机会性的肠外致病性大肠杆菌。黏质沙雷菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居细菌，也是临床上常见的机会致病菌，对人有致病性，但在动物的致病性报道于国内仅见于鳄鱼(Crocodylia)[15]和中华鳖(Pelodiscussinensis)[16]。但值得注意的是，本研究从3头病麝皮下脓肿均分离到黏质沙雷菌，提示其致病性应当受到重视。该养殖场使用山泉水浸泡过夜的包谷饲喂林麝，可能使包谷受黏质沙雷菌污染，进而引起机会感染。值得思考的是，不同学者报道引起林麝脓肿的病原菌种类往往不同[2-6]，本试验除发现大肠杆菌，还首次发现黏质沙雷菌对林麝也有致病性。据此推测，林麝在人工养殖条件下，易出现免疫功能下降，使各种机会致病菌“有机可乘”，但因不同养殖环境的优势机会致病菌不同，所以从各养殖场分离得到的脓肿相关细菌种类也时常不同。本试验分离得到的大肠杆菌和黏质沙雷菌菌株对头孢曲松、头孢噻肟、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感，必要时可选用这几种药物对该场患脓肿个体进行治疗；但分离菌株对青霉素类药物及链霉素耐药，应该与该养殖场长期使用其治疗病麝，使病原菌经历药物选择有关。当然，考虑到全身用药对瘤胃菌群平衡的不利影响，建议对皮下脓肿个体先做穿刺排脓，再做局部注射(封闭)治疗。本试验还发现患病组血清天门冬氨基酸转移酶显著高于正常对照组，提示使用抗生素治疗时应同时采取保肝、护肝措施，如增加饲喂鲜绿饲料、注射水溶性维生素或还原型谷胱甘肽，还可在饲料中尝试添加五味子粉。从该场实施临床治疗的结果看，约有1/3的个体未能治愈，表明及时发现病例并给予药物治疗是必需的，但这不够，还需要被治疗的个体有良好的免疫力来配合药物治疗。

笔者进一步认为，林麝脓肿病发生的根本原因是免疫力下降或皮肤、黏膜等生理屏障结构遭到破坏。具体说，饲料种类、饲养环境及遗传因素与脓肿病发生的关系值得重视。林麝在野外生存条件下，对营养物质摄入较为全面或合理。相比之下，人工养殖林麝大多喂予不具足够适口性的干料或半干料，会导致营养摄取不全面，进而引起免疫力低下，甚至因采食枝条刺伤口咽黏膜，给机会致病菌入侵机体提供了必要的条件，所以脓肿部位形成于颈部的病麝较多。胡周强等[17]发现，以饲喂干饲料为主的林麝场脓肿病发生率明显较高。本试验所调查的麝场，长期饲喂包谷为主要成分的饲料，鉴于病理剖检发现病死个体有胃黏膜溃烂，不排除食入较多淀粉后发生代谢性瘤胃酸中毒而引起瘤胃壁受损，进而使瘤胃内机会致病菌，如肠外致病性大肠杆菌，沿门静脉循环进入肝脏等组织的可能，这与内脏脓肿病集中发生于肝脏的发现一致。在人工养殖条件下，林麝的采食习性及生活环境发生强制性改变，可能是脓肿病发生的主要诱因。林麝天性胆小，一受惊吓便会在圈舍内来回蹦跳，易造成体表损伤，养殖人员难以及时发现和处理伤口，同时强烈的应激反应会下调免疫力，这些因素均会增加机会致病菌感染的机会。该场工作人员生活区与林麝圈舍距离近、林麝粪便清理不及时、饲养设施消毒不规范、脓肿内容物未集中消毒、缺乏病麝专用隔离圈舍，应该与该场林麝脓肿病频发有关。笔者认为，改善林麝生活环境，加强生物安全措施，保证营养供给，适当减少包谷饲喂量，尽量遵循林麝的自然习性，如实施半放养模式，从而改善免疫力，才是预防林麝脓肿病发生的根本出路。

本研究调查的林麝来自一个数量约100 头的小种群，可能也是脓肿病频发的一个重要基础因素。已知动物种群的抗病力受主要组织相容复合体(MHC)等多基因的调节。MHC是有颌脊椎动物体内负责编码递呈抗原肽、启动特异性免疫应答及卷入炎症应答的关键基因群[18]。国内研究表明，患脓肿病的林麝种群易感等位基因和基因型的频率均高于抗病等位基因和基因型[19]。人工养殖林麝主要采取自繁自养的管理模式，会加剧林麝种群的退化。尤其是近交繁殖，很容易使MHC多态性趋于狭窄，这可能是人工养殖林麝易患感染性疾病的重要遗传因素。因此建议定期从其他养殖场或野生种群引入适当数量的林麝个体进行繁育，以提高MHC多态性和群体抗病力，防止近亲繁殖引起的麝群退化。最近，国内学者通过比较分析健康和患脓肿病林麝的血液转录组，发现差异表达基因主要是一些与调节免疫应答有关的基因[20]。本研究认为脓肿病发生的根本因素在于免疫力下降的观点与该研究结果是一致的。