干酪乳杆菌对酒精依赖大鼠戒断反应的影响

肖倩倩 杨婕 羊大儒 严憬 韩业盛 李宗慧

摘要：目的：研究干酪乳杆菌对酒精依赖大鼠酒精戒断反应及复饮酒量的影响，从而深入探究在酒精依赖过程中干酪乳杆菌介导的酒精戒除作用。方法：健康雄性大鼠35只，所有大鼠适应性饲养一周后给予含酒精6%（V/V）的水溶液（下同），水溶液作为唯一水源24 h自由饮用，建立酒精依赖大鼠模型，建模5周后，随机选取造模成功的28只大鼠，随机分为模型对照组（A组），干酪乳杆菌低剂量组（B组）和干酪乳杆菌高剂量组（C组），安定水溶液阳性对照组（D组）。再通过灌胃给药的方式进行干预，A组大鼠灌胃普通饮用水，B、C组大鼠分别给予干酪乳杆菌4×108 CFU/（kg·d）和8×108 CFU/（kg·d），D组大鼠给予1.6 mg/kg安定水溶液，干预时间为6周，同时A、B、C、D组大鼠每隔三天给予酒精水溶液维持其酒精依赖并观察其酒精水溶液饮用量。观察各组大鼠在每次撤除酒精后酒精戒断综合征（通过酒精戒断评分表对刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势进行评分）、大鼠在旷场试验箱5 min内中央区所待时间、站立次数比较。结果：干酪乳杆菌干预的B、C组大鼠酒精戒断症状较模型对照组有明显差异（P<0.05），再次饮酒量也相比模型对照组显著降低，其探究行为（站立次数）和水平动机活度（中央区时间）与模型对照组比较，无显著差异（P>0.05）。结论：干酪乳杆菌对酒精依赖大鼠行为可能存在影响，进而改善酒精成瘾相关症状，为酒精成瘾治疗和戒断提供新方向。

关键词：干酪乳杆菌;酒精依赖大鼠;酒精戒断反应;肠道菌群;旷场试验

酒精依赖症是指大剂量长期饮酒使得机体对酒精产生了心理和生理上的隐癖[1]。临床表现为强烈和强制的饮酒渴求，停止饮酒时可见酒精戒断综合征，主要表现为焦虑、烦躁、抑郁、心悸甚至震颤等戒断症状。近年来发现肠道微生物可能在酒精依赖发生发展中起到重要作用。肠道微生物参与调节免疫系统、代谢内分泌和中枢神经递质及相应受体功能[2～4]。研究肠道菌群在调控酒精依赖过程的机制，对于进一步揭示酒精依赖的成瘾机理，及找到新的治疗靶点具有重要意义。吴艳艳等[6]实验中，干酪乳杆菌干预后大鼠的忧郁行为明显改善，能影响大鼠神经系统，调节肠道菌群。本研究参照Turchan J[5]等学者的方法建立酒精成瘾大鼠模型，选用益生菌中干酪乳杆菌作为干预物，参照改良柳田知司评分表、旷场实验，初步研究干酪乳杆菌对酒精依赖大鼠戒断反应的影响。现报道如下：

1材料与仪器

1.1 实验动物

35只清洁级健康雄性大鼠，体质量（220±10）g，由长沙天勤生物技术有限公司提供。

1.2 实验药品

白酒从正规商场购买，干酪乳杆菌菌株由广东环凯微生物科技有限公司提供，安定片由海南省第一附属医院提供。

1.3 实验仪器

旷场反应箱。

2实验方法

2.1 制备酒精依赖大鼠模型

模型的制备参照Turchan J等[5]方法。具体方法：模型组大鼠的饮水换成含6%（v/v）乙醇的水溶液，24 h自由进食，每天9：00AM配置酒精溶液，连续饮用5 w，按照酒精戒断症状评分表分别于停止饮用酒精4 h、6 h、24 h进行评分，选取与正常大鼠酒精戒断症状评分有显著差别的大鼠纳入实验组。

2.3 干酪乳酸桿菌的制备

于广州环凯微生物有限公司购买冻干粉形式的干酪乳杆菌活化培养，37℃，MRS培养基。

2.4 动物分组与给药

取造模成功的大鼠28只随机分组，分为模型对照组、低、高浓度干酪乳杆菌组及阳性对照组共4组，每组7只。每日分别给予普通饮用水、4×108 CFU/（kg·d）、8×108 CFU/（kg·d）及安定水溶液1.6 mg/kg给予实验组大鼠灌胃给药。给药其间每3 d测一次体质量，并随着大鼠体质量变化调整给药量，一共给药6周。所有大鼠均以普通饲料喂养，并自由饮水，每隔3 d给予1次酒精干预，记录饮酒量。

2.5 酒精戒断症状评分

将停止饮用酒精水溶液后6 h大鼠置入检测箱，同时摄像并记录5 min大鼠的自发性刻板行为、激惹性、尾巴强直及异常步态，每个项目按症状出现频率和轻重程度分为1～4级，4个项目相加即为总分，总分越高戒断症状越严重。

2.6 旷场实验

旷场试验反映动物动机行为。将大鼠放置在旷场中心内，观察10 min，记录后5 min内动物爬格数，以动物多于1/3的身体超过线而在不同的格子内为过线，爬过一格得1分;动物站立次数，以动物双前腿起，重量全在后腿上为站立，站立一次为1分。

3统计学方法

采用SPSS25.0统计学软件分析处理数据，实验结果以（±s）表示。

4结果

4.1 造模情况

大鼠连续饮用酒精水溶液28 d后大部分大鼠造模成功，与造模前酒精戒断症状评分有显著差异。

4.2 灌胃干预后大鼠酒精戒断症状变化

给药前各组大鼠酒精戒断症状评分比较，无明显差异。于第三周时B、C组大鼠酒精戒断症状评分开始与A组有明显差异，D组大鼠第二周时酒精戒断症状评分即有明显差异，于第五周时B、C组大鼠酒精戒断症状评分下降明显。

4.3 旷场实验

干预前后其行为学未见明显差异。

4.4 饮酒量变化

在干预前各组饮酒量无明显差异，干预后不同时间单位干预下A组饮酒量（X=155.6 ml）明显高于C组（X=116.2 ml）、D组（X=136.7 ml）饮酒量。

5讨论

本研究采用含6%酒精水溶液作为唯一饮水源，建立稳定的酒精依赖大鼠模型。模拟人类酒精戒断过程。本研究结果显示，给予灌胃低、高浓度干酪乳杆菌的酒精依赖大鼠，其酒精戒断症状评分明显低于对照组;与安定水溶液组相比，高浓度干酪乳杆菌与其酒精戒断症状评分无显著差异;而再次给高浓度干酪乳杆菌组酒精水溶液时其饮酒量明显低于对照组，相比于安定组，其饮酒量也较低。说明干酪乳杆菌能明显改善酒精依赖大鼠的酒精戒断症状，其效与安定水溶液类似。但对大鼠再次饮酒量有明显降低作用，其效果明显优于安定水溶液。表明干酪乳杆菌对酒精依赖大鼠的酒精戒断症状有明显改善作用，并可减少再次饮酒时的饮酒量。可能是与干酪乳杆菌可影响酒精依赖相关神经递质，及调节下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴），并影响某些炎症介质有关。有研究显示，酒精摄入后可引起多巴胺、五羟色胺的浓度改变，从而改变大脑兴奋性，引起焦虑抑郁情绪和冲动性增强 ，而人体肠道可分泌多种神经递质，在5-HT、GABA和多巴胺合成发挥重要作用，干酪乳杆菌可能通过这种机制影响神经递质合成，从而影响酒精依赖大鼠的行为。目前，酒精依赖患者停止饮酒出现焦虑抑郁等戒断症状，成为临床酒精戒断的一大阻力，多采用苯二氮卓类药物用于缓解临床症状减轻其焦虑情绪，但其副作用及成瘾性成为其一大弊端。而干酪乳杆菌作为一种益生菌对酒精依赖患者并无副作用，能调节肠道微生态而改善酒精戒断症状，这为肠道菌群介导的酒精依赖深入研究及治疗酒精戒断症状的新药提供了新的方向。

参考文献

[1]郝伟.酒精相关障碍的诊断与治疗指南[M].北京：人民卫生出版社，2014：2-8.

[2]Wei-Hsien Liu，Hsiao-Li Chuang，Yen-Te Huang，et.a1 Alteration of behavior and monoamine levels attributable to Laetobaeillus Plantarum PS128 in germ-free mice [J].Behav Brain Res，2016，298（PtB）：202-209.

[3]Dinan T G，Stanton C，Cryan J F.Psyehobiotics：a novel class of PsychotroPic[J].Biol Psychiatry，2013，74（10）：720-726.

[4]Clarke G，Grenham S，Scully P，et a1.The microbiome-gut-brain axis during early life regulates the hiPPocamPal serotonergic system in asex-dePendent manner[J].Mol Psychiatry，2013，18（6）：666-673.

[5]Canicella S，Ron D，Barak S.Intermittent ethanol access schedule in rats as a Preclinical model of alcohol abuse[J].Alcohol，2014，48（3）：243-252.

[6]汪冠豪，郑璐璐，许东坡，等.肠道菌群功能与成瘾机制的研究进展[J].微生物学杂志，2018，38（4）：105-113.