制首乌和生首乌对小鼠大脑β-淀粉样前体蛋白裂解酶1影响的对比实验研究

农嘉琦 梅金钰 李芳蕾 俞巧玲 梁菊华 钟世茂 黄鸥飞 张树球 杨艳萍

摘要：目的：探讨中药制首乌和生首乌对小鼠脑组织β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（β分泌酶， BACE1）及其他相关酶的影响。方法：将30只小白鼠分成三组，每组10只，即实验1组，实验2组，正常组;实验1组用制首乌提取液灌胃，实验2组用生首乌提取液灌胃，正常组不治疗，连续30天。灌胃20天测1次血红蛋白，实验结束，取血，分离血清测定生化指标，处死动物，取大脑，匀桨，用生理盐水制成10%脑匀桨，放4-8℃冰箱保存。结果：实验1组，实验2组，正常组;依次分别为，脑匀桨β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（ BACE1） 33.28±3.99、32.24±3.2、35.52±4.08（ U/L），与正常组比较，P<0.05，差异有统计学意义;血清谷丙转氨酶（ALT），85.65±13.82、97.13±16.84、70.53±6.84 （U/L） ，与正常组比较，，P<0.01，组间差异有统计学意义。结论：制首乌和生首乌对大脑（ BACE1）活力有明显的抑制作用，以生首乌更明显，这是何首乌抗衰老，抗痴呆的基础，但它对肝功能也产生影响，用量需控制。

关键词：何首乌（生，制）;β分泌酶（β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1;BACE1）老年痴呆症;

【中图分类号】R955 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）07-002-01

何首乌是蓼科植物何首乌（Polygonummuhiflorum Thunb）的干燥块根，是历代的补益中药。何首乌有解毒，消痈，润肠通便的功效，制何首乌主要用于补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨……。近年来的研究发现，何首乌具有降血脂、增强免疫、抗氧化、延缓衰老等广泛的药理学活性，这与其主要化学成分的药理活性密切相关。二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分[1]。生、制首乌在临床上用法有区别，制首乌偏于补血，而生首乌偏于活血，生首乌毒性较大，经高温炮制成制首乌后，毒性减小[2]。本文利用小鼠作研究对象，用制首乌和生首乌水提取液灌胃，测定小鼠脑β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1活力等，探讨疗效及机理，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 试剂 高铁氰化钾、氰化钾、碳酸氢钠、氯化钠、甲醛、盐酸（HCL）、均为国产分析纯。各种测试盒，甘油三酯（TG）测试盒、總胆固醇（TC）测试盒、谷丙转氨酶测试盒，购自南京建成生物工程研究所科技有限责任公司。β-分泌酶1（蛋白裂解酶1，BACE1）测试盒购自上海江莱生物有限责任公司。

1.2中药 何首乌（生），购自本市市场，原产本地农村，经切片，高温炮制7次，55℃烤干成制首乌干品，。生，制何首乌，分别经加热水提取，乙醇沉，去沉淀，去乙醇，制成口服水溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 动物，小白鼠30只，昆明种，清洁级，健康，雌雄各半，鼠龄2个月。由学院动物室提供（动物使用许可证号：SYXK桂2011-0010。动物生产许可证号：SCXK桂2012-0003.）.

1.2.2动物实验 分笼喂养，每笼5只，分三组，每组10只， 实验1组， 实验2组，正常组; 实验1组用制首乌提取液灌胃， 实验2组用生首乌提取液灌胃， 正常组不灌、每天一次，连续30天. 灌胃到20天测1次血红蛋白. 结束实验， 从眼球后取血、分离血清放普通冰箱待用，测定生化指标;处死小鼠，取肝肾器官，放甲醛浸泡，作病理检查;取大脑，制成10%脑匀浆.

1.2.4测定方法 血红蛋白Hb测定，取小鼠尾巴全血20ul，用高铁氰化钾（HiCN法）测定，具体操作参考文献[4]。实验结束， 从眼球后取全血，分离血清， 测定生化指标：甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）; 处死小鼠，取大脑组织，在冰浴下用玻璃匀浆器研磨，用生理盐水制成10%脑匀浆， 3000rpm离心10min，取上清放4-8度冰箱保存待用，测定BACE1：血清ALT用改良赖氏法测定;TC用COD-CE-PAP测定;TG用GPO-OAO法测定;β-分泌酶1测试采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理 数据用SPSS-13软件处理，进行方差分析和Q检验，结果用（）表示。

2.结果

2.1小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、脑匀浆BACE1含量测定结果， 谷丙转氨酶，各组间比较， 差异有统计学意义; 脑匀浆BACE1， 各组间比较差异有统计学意义; 见表1.

方差分析：谷丙转氨酶，各组间比较，F=5.448，p=0.017， 与正常组比较， P<0.01，组间差异有统计学意义; 脑匀浆BACE1， 各组间比较，F=2.274，p=0.119，与正常组比较， P<0.05， ， 差异有统计学意义;

2.2 血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血红蛋白Hb含量测定结果。结果显示， TG， 各组间比较， 差异有统计学意义; （TC） ， 各组间比较，差异无统计学意义; 血红蛋白Hb，各组间比较，差异有统计学意义。见表2.

方差分析： TG， 各组间比较，F=6.345，p=0.011， 差异有统计学意义; 与正常组比较： P<0.05，P<0.01; TC， 各组间比较，F=1.604，p=0.236，，差异无统计学意义; 血红蛋白Hb， 各组间比较，F=4.614，p=0.026，，与实验2组比较， P<0.05，差异有统计学意义.

3.讨论

何首乌是历代的补益中药 。主要有补肝肾，益精血 ，乌须发，强筋骨等功效。近年来的研究发现 ，何首乌具有降血脂、增强免疫 、抗氧化 、延缓衰老等广泛的药理学活性. 因而在临床上有广泛的应用，特别在抗衰老方面，而在老年痴呆症治疗方面也获得较好的效果[3]，本文的研究结果进一步证明. 老年痴呆症又称阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD，）是最常见的一种渐进性中枢神经系统退行性疾病，是一种快速的衰老， 病因未明，机理复杂，其主要病理特征为细胞外 β 淀粉样肽（β-amyloid，Aβ） 沉积形成老年斑（senile plaques）， 细胞内Tau 蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles）[1]，神经纤维变性细胞减少和间质胶质细胞增生四方面. 制首乌和生首乌对大脑（ BACE1）活力有明显的抑制作用，以生首乌更明显，这是何首乌抗衰老，抗痴呆的基础.根据β 淀粉样肽学说， β 淀粉样前体蛋白，正常经a分泌酶与r分泌酶配合催化水解成可溶性肽并最终水解成氨基酸，而经β分泌酶（BACE1）与r分泌酶配合催化生成β 淀粉样肽，其二级空间结构是β折叠型，易沉淀而不被水解，最终在细胞外形成老年斑，正常衰老也存在老年斑，但较少，而老年痴呆症却大量增加，影响神经正常传导功能.本实验证明制首乌和生首乌对大脑（ BACE1）活力有明显的抑制作用，以生首乌更明显，从而减少形成老年斑，达到抗衰老，治疗阿尔茨海默病（老年痴呆症）的作用.

近年来文献常有报道，临床使用何首乌制剂病人出现肝功能损害的现象.本文实验也证明，何首乌有一定毒性，主要是对肝脏损害，引起转氨酶升高，以生首乌较明显，与中医理论相符合，经高温炮制后毒性降低，中药何首乌炮制是九蒸九晒成制首乌，无毒， 炮制后成分发生了转变，如蒽醌结合型高温后变成游离型， 毒性发生转变.所以炮制时间一定要够，不能偷工减料减时间，同时用量也需严格控制，否则容易造成肝功能损害.本文实验其他指标变化不明显.

参考文献：

[1].高任龙 王会 肖 李晓娜 等. 何首乌的药理毒理研究进展.河北医药 2015， 37（2）： 269-271

[2]. 胡锡琴 杨红莲 张 晓 琴 苗 等. 制何首乌对大鼠肝脏毒理的实验研究.·陕西中医学院学报， 20O6， 29（ 3）： 40-41

[3] 马 允， 张树球 ， 梁月秀等 . 乌圆补血口服液对拟老年痴呆症小鼠脑乙酰胆碱酯酶的影响. 中国临床康复 2005，9 （44）：94-97

[4]叶应妩 ，王毓三 ，主编 . 全国临床检验操作规程 南京[ M] 2版 ， 南京：东南大学出版社， 1997.

项目名称及编号：创建《中草药原料种植基地》201910599003