牛型结核菌素皮内变态反应和胶体金快速检测方法对比试验

罗鹏飞,王金泉,特列克·库拉别克,张 琦

(1新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心,新疆 阿勒泰 836500;2.新疆农业大学动物医学学院;3.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所；4新疆阿勒泰地区动物卫生监督所)

牛结核病主要由牛分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病该病在全球范围内广泛流行牛结核病可以通过病畜传染给人或其他动物世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疾病。目前,牛结核病的发病率在我国一些省份呈上升趋势,有的已达到6%甚至更高的阳性检出率,该病在新疆地区的发病率一直都比较高,尤其是在农牧区,严重威胁畜牧业的健康发展。因此,建立可靠的诊断检测技术对防控该病至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物及受试血清:阿勒泰地区从其他地方分批次引进的415头西门塔尔牛,用于牲畜品种改良,集中隔离期间统一由兽医人员采集415头份全血,分离血清待检。

试验材料:牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试纸,购自武汉生物科技有限公司, 结核菌素 (由地区动物疾病控制与诊断机构提供),20μL加样枪、塑料吸头、酒精棉、游标卡尺、注射器、个人防护用品等。

1.2 方法

1.2.1 结核菌素(PPD)皮内变态反应(tubculin skin test,TST) 将待检牛只全部编号后,在颈侧中部上1/3处剪毛,直径约10 cm。用游标卡尺测量注射部位中央皮皱厚度,做好记录。用75%的酒精棉消毒注射部位,然后皮内注射0.1mL的结核菌素原液,注射后局部应出现小泡。

皮内注射后经过72 h判定结果,观察注射部位局部有无红肿热痛的炎性反应,并以游标卡尺测量术部肿胀区域(或部位)的大小和皮皱的厚度,做好记录。在72 h观察后呈阴性和可疑反应的牛须在第1次注射的部位,以同样的剂量进行第二次注射,再经过48 h观察结果。对于阴性牛和疑似反应牛,于注射96 h和120 h再观察一次,以防止个别牛出现较晚的迟发性变态反应,所有结果全部进行记录。

判定标准: (1)阴性反应：注射部位无炎性反应,皮厚差(指注射PPD前后皮皱测量厚度的差值)在2 mm以下。(2)疑似阳性反应：局部炎性反应不明显,皮厚差≥2.0 mm,<4 mm。(3)阳性反应：局部出现明显的炎性反应,皮厚差≥4.0 mm。凡判定为疑似阳性反应的牛,于第一次检疫后60 d进行复检,其结果仍为可疑,经60 d再复检,如仍为疑似反应,则直接判定为阳性。

1.2.2 抗体胶体金检测方法 室温条件下,用加样枪吸取待检牛血清,向牛结核MPB70/83抗体胶体金检测试纸条样品孔滴入1滴,可见在试纸条上出现红色条带移动。若5min内仍未出现条带移动,则需要在样品孔中再次滴入待检血清1滴,10 min后再观察,若超过30 min仍未出现结果,则说明操作失败,应更换试纸条重做。若室内温度低于15℃,则应相应延长结果观察时间。

判断标准: (1) 阴性：在检测试纸条上只出现一条紫红色参考对照(Control)带。(2) 阳性：在检测试纸条上出现检测带(T)、对照带(C)两条紫红色条带。(3) 无效：检测试纸条上未出现任何条带或没有出现C条带。

2 结果和分析

2.1 结果

应用牛型结核菌素(PPD)皮内变态反应和胶体金快速检测方法对415头份牛血清样本进行检测,检测结果详见附表。

表 牛型结核菌素(PPD)皮内变态反应、胶体金快速检测结果

对415份牛血清样本用牛结核MPB70/83抗体胶体金试纸条检测牛结核病,与TST进行比较。结果显示,TST阳性牛9头,牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试验阳性牛7头,两组结果阳性符合率为77.8% (7/9) ；TST阴性牛406头,牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试验阴性牛408头,阴性符合率为99.51% (406/408)。

2.2 结果分析

结果显示,对牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试验和结核菌素皮内变态反应进行生物统计学分析结果显示,胶体金试纸条检测与TST具有一定符合率,采用x2检验法两种检测方法差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

在实际应用中,牛型结核菌素皮内变态反应是国家动物结核病检疫行业标准。这种检测方法存在的不足是显而易见的,但这种检测方法迄今为止得到了大家的一致公认。世界动物卫生组织 (OIE)和我国都将此方法列为牛结核病检疫的一个标准试验。由于牛结核病非常顽固,检疫净化是消灭该病的最有效方法,如果只是采用单一的TST易造成人为误差可能出现假阳性和假阴性,无法对其做出准确检测。因此,采取多种辅助方法作为检测手段,对于提高检测的准确性具有十分重要的意义,而目前r-干扰素酶联免疫试验 (ELISA)、聚合酶链反应(PCR)及胶体金快速检测等方法,都可以作为TST的补充检测方法,在根除牛结核病的实际应用中具有一定的发展前景。但因ELISA或免疫金标方法,均因结核病引发体液免疫的时间滞后性,不便于操作,或成本过高等原因,妨碍了其在兽医临床中的推广应用。γ-干扰素 ELISA 可以检测早期感染牛只,特异性较高,易于标准化,但γ-干扰素ELISA需在采血后24h内检测,且试剂盒的成本较高,故难以推广应用于临床。PCR虽然具有高敏感性和强特异性,但需要做好前期的准备工作,且要满足较高的试验检测要求与条件,故亦难以推广应用于临床。随着胶体金快速检测技术临床应用的发展,进一步提高胶体金快速检测试验的敏感性、特异性,实现多元、定量或半定量检测或将成为未来胶体金检测技术发展的方向。

4 结论

牛型结核菌素(PPD)皮内变态反应是我国动物结核病检疫的行业标准,该方法具有操作简单,易于掌握,皮试所需实验条件门槛不高,费用比较低,易于推广的优点,但缺点是检疫结果容易受人为因素影响,耗时耗力,可出现假阳性或假阴性。由于胶体金快速检测试剂盒具有快速、简便、特异、灵敏的特点,目前已被当做一种牛结核病的辅助诊断方法广泛应用于阿勒泰地区的边远牧区、养殖场等一些不具备实验室条件的基层一线,具有一定的应用前景。但因胶体金快速检测试剂盒价格昂贵,产品多样化,加之不同厂家和不同批次产品之间的灵敏度差异显著的原因,导致其在兽医临床应用滞后。

综合分析,随着现代畜牧业的快速发展,阿勒泰地区这几年从疆内外引进品种畜较为频繁。尤其是在牛的引进渠道上较为广泛。很多时候牛只在输入之前早已患病,成为传染源是导致牛结核病流行的重要因素之一。在这样的一种情况下,牛结核病疫情逐渐受到当地党委政府的高度重视,综合防控措施也在不断加强,病原检出阳性率和检疫阳性率均有了明显下降。但是,从数据分析来看,输入性牛结核病风险还是依然存在的,发病以奶牛居多,这就需要党委政府不断增强防控力量,特别是农业农村部门应采取综合防控措施,严格按照国家牛结核病诊断技术操作规范进行,在条件允许的情况下运用多种检测方法可有效提高检测准确性,减少误判,而在生产实践中还是应坚持执行严格的隔离制度和严格的检疫净化制度,对检疫阳性牛一律作无害化处理。