HPLC法同步测定烫狗脊标准汤剂指纹图谱及原儿茶酸含量

黄燕明，李雪银，陈桂生，汪 静，康志英，2，3

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300；3.广东香雪南药发展有限公司，广东 肇庆 526600)

狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，又称为百枝、金毛狗脊、苟脊、金扶筋等[1]。狗脊是一味经典药材，历代沿用，其具有祛风湿、补肝肾、强腰膝的功效，多用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力，为骨伤科疾病常用的中药之一[2]。烫狗脊是狗脊药材经砂烫制后所得饮片。由于狗脊药材外表覆盖绒毛，需经炮制去毛后使用。标准汤剂是以中医药理论为基础，按照临床汤剂规范进行煎煮，是广泛应用于临床的一种用药形式以及中药配方颗粒的标准参照物。虽然狗脊使用历史悠久，但查阅相关文献发现，对于其质量研究的报道并不多，尤其是指纹图谱研究[3]。本研究收集15批不同产地的烫狗脊饮片，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，分别制备成15批烫狗脊标准汤剂，并建立同步检测其指纹图谱及原儿茶酸含量的方法，为烫狗脊标准汤剂的质量评价提供参考依据[4-6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1260 DAD)；三孔电热恒温水箱(DK-80，上海一恒科学仪器有限公司)；百万分之一天平(Mx5，Mettler Toledo)；十万分之一天平(XP205DR，Mettler Toledo)，超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇(飞世尔，批号：190258，色谱级)，冰醋酸(阿拉丁，批号：D190888，色谱级)，乙腈(阿拉丁，批号：193730，色谱级)，甲醇(广州化学试剂厂，批号：20190501-11，分析纯)，冰醋酸(广州化学试剂产，批号：20180904-2)。

1.3 对照品

原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201205)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，批号：110810-201608)；5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201912)。

1.4 样品

共收集15批烫狗脊饮片，其中9批产自海南省，3批产自广西，3批产自云南省。样品经广州市香雪制药股份有限公司高级工程师康志英鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 标准汤剂制备

取烫狗脊饮片100 g，煎煮2次，第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，滤过；第2次加水7倍量，煎煮20 min，滤过，滤液合并，减压浓缩至生药浓度约为1∶1(g∶mL)的浸膏，冷冻干燥，即得。

2.2 色谱条件与系统适应性试验

以乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)为流动相，色谱柱为 Kromasil 100-5-AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为260 nm进行检测。理论塔板数按原儿茶酸峰计算应不低于3 000。

2.3 参照物溶液的制备

原儿茶酸对照品溶液：取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。原儿茶醛对照品溶液：取原儿茶醛对照品适量，精密称定，加甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。狗脊对照药材溶液：取狗脊对照药材约1 g，置具塞锥形瓶中，按“供试品溶液制备”项下方法制备。

2.4 供试品溶液的制备

称取本品粉末约1 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液25 mL，加热回流30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 15批烫狗脊标准汤剂检测结果

分别取15批烫狗脊标准汤剂按“2.4”项下的供试品制备方法制成供试品溶液，再按“2.2”项下的色谱条件进行检测。结果15批烫狗脊标准汤剂色谱峰信息丰富，分离度符合要求，峰型好。其中，7个色谱峰稳定呈现，故确定7个峰为烫狗脊标准汤剂指纹图谱的共有峰。与对照品溶液比对分析，确定峰3为5-羟甲基糠醛，峰6为原儿茶酸，峰7为原儿茶醛峰。同时，计算15批烫狗脊标准汤剂原儿茶酸的含量平均值为1.35 mg·g-1，RSD平均值为1.13%。见图1。

表1 15批烫狗脊标准汤剂含量

3 指纹图谱方法学考察

3.1 专属性试验

按照色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入色谱仪，记录色谱图，供试品溶液记录原儿茶酸2倍以上采集时间色谱图，结果如图2所示，供试品溶液在5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、原儿茶醛色谱峰相应的保留时间检出色谱峰，阴性溶剂对供试品溶液没有干扰。

图2 专属性试验结果

3.2 重复性试验

按照“供试品溶液制备”项下平行制备6份样品，以色谱条件进行重复性考察，结果各供试品色谱峰保留时间RSD均在2%以内，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》进行相似度评价，各图谱共有峰与对照指纹图相似度均大于0.99，表明该方法重复性良好。

3.3 稳定性考察

按照供试品制备方法项下制备供试品溶液，照色谱条件分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h进行进样测定，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》进行相似度评价，各图谱共有峰与对照指纹图相似度均大于0.99，表明烫狗脊标准汤剂供试品溶液在48 h内稳定性良好。

3.4 中间精密度考察

分别考察不同人员、不同日期、不同仪器对精密度的影响，结果不同影响因素下各指纹图谱共有峰相对保留时间无明显变化，表明该方法精密度良好。

3.5 耐用性考察

取同一批烫狗脊标准汤剂供试品溶液，分别考察了不同色谱柱、不同流速，测定烫狗脊标准汤剂指纹图谱，以3号峰5-羟甲基糠醛峰为参照，各共有峰相对保留时间无明显变化，表明该方法耐用性好。

4 含量测定方法学考察

4.1 系统适应性试验

精密吸取对照品10 μL，连续进样6次，测定，记录色谱图，分别计算参照物峰面积及保留时间平均值和RSD值，原儿茶酸对照品溶液的峰面积RSD为1.1%，以及保留时间RSD为 0.6%，表明该方法参照物溶液具有系统适用性。

4.2 线性关系及其范围

取原儿茶酸对照品溶液(浓度：56.18 mg·mL-1)，采用自动进样器分别进样1 μL、2 μL、5 μL、8 uL、10 μL、15 μL，即进样量56.18 mg、112.36 mg、280.90 mg、449.44 mg、561.80 mg、842.70 mg，在260 nm下测定，以原儿茶酸峰面积积分值A对原儿茶酸对照品的进样量C进行回归分析，其回归方程为：A=3436.395 28C-0.136 94，相关系数r>0.999 9，结果表明原儿茶酸在56.18 mg～842.70 mg范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系。

4.3 重复性试验

同“3.2”项下进行含量测定，计算原儿茶酸的含量和RSD值，标准汤剂平行制备的6份供试品溶液各峰的相对保留时间RSD值均小于2.0%，原儿茶酸的含量平均值为1.6 mg·g-1，RSD为0.8%，表明该方法重复性良好。

4.4 稳定性试验

同“3.3”项下进行含量测定，计算原儿茶酸含量和RSD值。原儿茶酸的平均含量为1.5 mg·g-1，RSD为1.0%，表明该供试品溶液在48h内稳定性良好。

4.5 加样回收率

精密称取已测原儿茶酸含量的狗脊标准汤剂(批号：201903001BT，平均含量为1.6 mg·g-1)适量，平行9份，分别精密加入低、中、高浓度的原儿茶酸对照品，按供试品项下操作，依法测定，计算回收率(见表2)。

表2 烫狗脊标准汤剂含量测定加样试验结果

4.6 中间精密度试验

同“3.4”项下测定，原儿茶酸的平均含量为1.6 mg·g-1，RSD为1.2%，说明该方法中间精密度良好。

4.7 耐用性试验

同“3.5”项下测定，原儿茶酸的平均含量为1.5 mg·g-1，RSD为1.6%，说明该方法耐用性良好。

5 讨论

通过对狗脊药材的炮制工艺和化学成分进行调研分析[7-17]，按本研究色谱方法条件筛选，分别考察流动相系统、供试品提取溶媒和供试品提取方式等因素。流动相系统：流动相1：乙腈-1%冰醋酸溶液(5∶95)，流动相2∶乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)，流动相3：甲醇-1%冰醋酸溶液(12∶88)，流动相4：A甲醇-1%冰醋酸溶液(8∶92)进行检测，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃。试验结果表明，当以流动相为乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)时供试品溶液各色谱峰分离度较好且峰型、色谱峰数目适宜，确定烫狗脊标准汤剂的流动相为乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)。

根据2015版《中国药典》狗脊“供试品溶液制备”项下，考察甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液、70%甲醇、烯乙醇三种不同溶媒提取效果。结果以甲醇-1%冰醋酸(70∶30)为提取溶媒提取的色谱图上峰面积比值较大，因此选用甲醇-1%冰醋酸(70∶30)为溶剂。

另对比考察加热回流与超声处理两种提取方式下供试品溶液各成分含量差异，结果发现，采用加热回流的方式所测得各峰峰面积比值较大，因此本方法采用加热回流提取方式进行供试品溶液的制备。

综上所述，本研究建立的烫狗脊标准汤剂同步测定其指纹图谱及原儿茶酸含量的方法可靠，重现性、准确性好，为烫狗脊配方颗粒质量标准研究提供参考依据。