超声波、NaCl胁迫及协同处理对苦荞麦萌发、生理变化及抗氧化性的影响

王思蒙，黄闽凤，许先猛，王顺民，陈 明

(安徽工程大学 生物与食品工程学院，安徽 芜湖 241000)

苦荞麦(

Fagopyrum

Tataricum

Gaertn.

)作为双子叶荞麦属植物，富有营养和医药价值，一直被公认为“药食两用”的优秀农作物之一。苦荞麦含有其他主要作物所缺乏的黄酮等药用成分，能预防和治疗多种疾病，近年来，人们对其的利用产生了新的兴趣。

超声波技术是一种通过安全高效的物理刺激，改善植物性食物如麦苗、豆芽的食用性和营养质量的一种新方法，已被广泛应用到农业领域。有报道称，在0～300 W超声波处理后，大豆的萌发率以及芽苗中的GABA (γ-aminobutyric Acid)、大豆甙元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)的含量显著提高，但大豆异黄酮(Isoflavone)、黄豆苷(Daidzin)和染料木苷(Genstin)含量显著下降。大麦种子经52～414 W超声波处理3～15 min后，其萌发率增加1.042～1.065倍，发芽时间缩短30%～45%。此外，还有报道称，超声波处理可以通过增强过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)等抗氧化酶的活性来缓解重金属给植物造成的毒害作用。

NaCl胁迫处理会影响种子的萌发、生长发育和渗透调节，促进植物体内一些活性物质的积累，但也可能会抑制植物组织和器官的生长。有报道称，荞麦、小麦和玉米在NaCl胁迫下其幼苗中CAT、SOD、POD和PPO的活性显著提高而丙二醛(MAD)的含量显著降低。有研究表明NaCl胁迫会使大麦芽苗中脯氨酸和可溶性蛋白等成分含量上升，并且低浓度的NaCl溶液对大麦种子的处理效果比高浓度的好。有研究表明10～200 mM NaCl的处理使苦荞芽苗中的总酚类化合物增加57%～153%，50 mM和100 mM NaCl处理的芽菜类胡萝卜素含量比对照组高出2倍。适当浓度NaCl的处理改善了幼芽的营养质量，包括酚类化合物、类胡萝卜素和抗氧化活性的水平。

目前关于超声波、NaCl胁迫处理对谷物萌发影响的报道较多，但是超声波协同NaCl胁迫处理对谷物种子的萌发及活性成分含量的影响报道较少。研究采用超声波、NaCl溶液，超声波协同NaCl溶液对苦荞麦种子进行处理，探索上述方法对苦荞麦萌发及生理生化指标(萌发势、黄酮含量、总酚含量等)的影响，从而为进一步提高苦荞的利用价值提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 原料

苦荞麦，购自宁夏盐池种子公司。

1.2 实验方法

(1)预处理。选择粒大、饱满的苦荞麦种子清水洗净，置于1.0 g/L高锰酸钾溶液浸泡10 min后洗至澄清。于25 ℃恒温培养箱中浸泡4 h，期间换1次水。后置于45～55 ℃的水中催芽15 min，后分若干份，每份150～180粒备用。

(2)超声波及NaCl胁迫处理。①超声波处理：取出3份经预处理过的种子置于盛着水的烧杯中，在29 ℃下，分别采用功率为240 W、280 W、320 W的超声波处理30 min(即T、T和T处理：U240 W/30 min+W(T)，U280 W/30 min +W(T)，U320 W/30 min + W(T))，沥水，培养。②NaCl溶液处理：取出3份经预处理过的种子置于2.5 mmol/L、5.0 mmol/L和7.5 mmol/L的NaCl溶液培养(即T、T和T处理)。③超声波协同NaCl溶液处理：取出3份经预处理过的种子置于超声波处理器中，在功率为320 W，温度为29 ℃下处理30 min，沥水，再分别置于2.5 mmol/L、5.0 mmol/L和7.5 mmol/L的NaCl 溶液中培养(即T、T和T处理)。另取出2份种子置于超声波处理器中，在功率为320 W，温度为29 ℃的条件下，分别处理20 min和10 min(即T和T处理)，沥水，再置于5.0 mmol/L的NaCl 溶液培养。同时做对照实验(未经超声波、NaCl溶液处理，对照组)。

(3)培养。将上述不同处理的种子均匀平铺在内衬双层滤纸的直径为10 cm的培养皿中，后移至种子培养箱中，于温度25 ℃，湿度为80%的条件下进行避光培养，每隔12 h补充一次溶液(其中T～T组补充蒸馏水，T～T组补充对应浓度的NaCl溶液)，每隔24 h统计一次萌发种子数，7 d后取长势均匀的芽苗进行称重、研磨，作为待测样品，测定各指标。

1.3 测定指标

(1)萌发率。自开始培养起，每隔12 h依次测量其萌发率(胚轴突破种皮1 mm即为萌发)，连续测定7 d，每组重复3次，直至达到预期的时间或个别处理组萌发率达到100%。采用游标卡尺分别测定其芽长和根长。

(2)过氧化物酶和超氧物歧化酶活性。取0.3 g苦荞芽苗样品洗净后置于预冷的研钵中，加入(2～3 mL)50 mmol/L预冷的pH 7.8的磷酸钠缓冲液(含1%PVP，0.1%疏基乙醇)和少量石英砂在冰浴上研磨成匀浆，在4 ℃、1 2000 g下离心20 min，上清液即为POD、SOD的粗酶液。POD活性的测定采用愈创木酚法，SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法。

(3)丙二醛。称取0.3 g苦荞芽苗，加入2 mL 10%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 mL TCA进一步研磨，匀浆离心(4 000 r/min)10 min，上清液为样品提取液。根据Jain稍作改进之后采用硫代巴比妥酸法测定MDA浓度。吸取2 mL提取液于试管中(对照管加2 mL蒸馏水)，各加入2 mL 0.6%(硫代巴比妥酸)TBA，混匀后，试管加盖塞，置于沸水浴中煮15 min，冷却，以4 000 r/min离心15 min，取上清液测定532 nm和450 nm以及600 nm的吸光度。

MDA浓度(umol/L)=6.45×(

D

532-

D

600)0.56×

D

450。

(4)还原糖。采用3,5—二硝基水杨酸法。取一定量的苦荞麦芽，加少量蒸馏水搅匀，置于50 ℃恒温水浴20 min，经过两次离心或过滤，取上清液进行还原糖测定。还原糖含量按式(1)计算：

(1)

式中,

C

为标准曲线方程求得的还原糖的量(mg)；

V

为提取液的体积(mL)；

a

为显色时吸取样品液的体积(mL)；

W

为样品重(g)。

(5)总黄酮。将一定量的苦荞麦芽置于研钵中，加少量石英砂，加入60%的乙醇进行研磨、提取，提取液用冷冻离心机在9 000 r/min下离心15 min，以离心后的上清液为样液，准确吸取0.5 mL样液于10 mL容量瓶。采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。

(6)总酚。称取(0.200 0±0.000 5)g样品冻干粉，加入5 mL 70%甲醇溶液，60 ℃超声处理(240 W/30 min)，提取2次，8 000 r/min离心10 min，过滤备用。采用Folin-酚法测定总酚的含量。

(7)DPPH清除能力。取苦荞麦芽苗乙醇提取液(60%乙醇，定容至50 mL)0.2 mL，加入7.8 mL浓度为0.025 mLDPPH乙醇溶液，立即混匀，在一定时间间隔内(10 min)测定其在517 nm处的吸光度。按式(2)计算：

(2)

式中,

A

为原始溶液的吸光值；

A

为参比溶液的吸光值；

A

为待测溶液的吸光值。

1.4 统计分析

每个试验独立重复3次，结果以平行测定所得的平均值和标准差表示。用SPSS软件进行单因素方差分析和Duncan多重检验进行分析，显著性水平为

P

<0.05。

2 结果与分析

2.1 萌发率

超声波及NaCl胁迫处理对苦荞萌发率的影响如图1所示。从图1a可以看出，苦荞麦种子经超声波处理后，培养0～96 h，超声功率240 W、280 W和320 W处理的种子萌发率高于对照组(P<0.05)。其中24～96 h，T处理组的萌发率显著高于低功率T组(P<0.05)。96～168 h，不同功率处理间萌发率差异不显著(P>0.05)。T处理的种子培养168 h (7 d)时，其萌发率为75.33%，分别比T、T和对照组高4%、0.67%和2%,说明超声波处理在培养初期对苦荞麦种子的萌发有一定的促进作用，其作用随超声波功率的增加而增强。Yaldagard曾报道超声波(92～414 W，5～15 min)处理可使大麦种子萌发期缩短30%～45%，本研究结果与其一致。从图1b可以看出，2.5～5.0 mol/L的NaCl溶液处理苦荞种子后，在培养0～96 h内对萌发有一定的促进作用。超过120 h时，NaCl溶液处理组的萌发率均与对照组差异不显著(P>0.05)。其中T处理后，168 h时，其萌发率为75.33%，分别比2.5 mmol/L和7.5 mmol/L处理组高1.33%和3.33%,说明低浓度NaCl溶液短时处理对苦荞麦种子的萌发表现为促进作用，而高浓度则呈抑制作用，其中5 mmol/L时效果最佳。

苦荞麦种子经超声波处理后，再以2.5～7.5 mol/L的NaCl溶液处理(见图1c和图1d)，培养0～7 d(除48 h时外)其萌发率均与对照组差异不显著(P>0.05)，说明超声波处理未改善苦荞种子对NaCl胁迫的适应能力以增加其发芽率。其中T处理，培养168 h (7 d)时，萌发率仅为78%,说明协同方式对种子在高浓度NaCl胁迫的适应能力的改善有限。

图1 超声波及NaCl胁迫处理对苦荞萌发率的影响注：对照组(即未经超声波、NaCl胁迫处理)。U240 W/30 min+W(T1)、U280 W/30 min+W(T2)、U320 W/30 min+W (T3)：分别为经超声波240 W、280 W、320 W处理30 min，用蒸馏水培养的组别；NaCl 2.5 (T4)、NaCl 5.0 (T5)、NaCl 7.5 (T6)：分别为未经超声波处理用浓度为2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L的NaCl溶液培养的组别；U320 W/30 min+ NaCl 2.5 (T7)、U320 W/30 min+ NaCl 5.0 (T8)、U320 W/30 min+ NaCl 7.5 (T9)：分别为经超声波320 W处理30 min，用浓度为2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L的NaCl溶液培养的组别；U320 W/20 min+ NaCl5.0 (T10)、U320 W/10 min+ NaCl 5.0 (T11)：分别为经超声波320 W分别处理20 min、10 min，用浓度为5 mmol/L的NaCl溶液培养的组别；下图同。

2.2 种子萌发势

超声波协同NaCl胁迫对苦荞种子芽长(7 d)的影响如图2所示。从图2a可看出，采用240 W、280 W和320 W功率的超声波处理苦荞麦种子，其芽长随功率的增强而增加，T组最高，比对照组增加14.72%。2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液处理苦荞种子，其芽长随NaCl溶液浓度的增加先减少后增加，但NaCl处理组均低于对照组，表现为抑制作用。超声波协同NaCl溶液处理下芽苗的长度均低于对照组。从图2b可看出，以功率为240～320 W的超声波处理苦荞麦，其芽苗根长度随功率的增加而增加，但均高于对照组(P>0.05)。NaCl溶液浓度由2.5 mmol/L增加到7.5 mmol/L，根长逐渐缩短，仅2.5 mmol/L NaCl溶液处理组比对照组高12.10%。苦荞麦种子经超声波处理后再协同NaCl溶液处理时，其根长均未高于对照组(P>0.05)。Mirshekari和Goussous证实40～60 KHz超声波预处理可以显著提高小麦种子幼苗根、茎长的生长，本研究的结果与其一致。

图2 超声波协同NaCl胁迫对苦荞种子芽长(7 d)的影响

2.3 POD和SOD活性

超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗POD和SOD活性的影响如图3所示。从图3a可看出，苦荞麦芽苗的POD活性随超声波功率的增加先升高后降低，其中T处理最高，达23.44±0.51 U·g·min，比对照组高19.21%，说明适度的超声波处理有助于提高芽苗的POD活性；2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液处理下，其芽苗的POD活性随NaCl浓度的增大而先升高后降低且均高于对照组(P<0.05)。T组处理下酶活力最高，达48.67±1.53 U·g·min，比对照组高1.47倍，说明NaCl处理可以提高芽苗的POD活性(P<0.05)。经超声波协同NaCl处理下芽苗中POD的活性随NaCl浓度的增加而升高，其中T组处理后芽苗POD活性最高，达47.56±2.14 U·g·min。相同NaCl浓度下，超声波协同NaCl处理组的芽苗中POD活性要高于对照组，而在NaCl浓度及超声功率相同的情况下，其芽苗的POD活性随超声波处理时间的增加而先升高后降低。其中，T组处理下的芽苗的POD活性最高，达61.78±1.68 U·g·min，说明超声波处理有助于提高苦荞麦芽苗的POD活性。

从图3b可看出，功率由240 W增至320 W，苦荞麦芽苗中SOD活性随超声波功率的增大而增加，T处理最高，达61.90 U/mg，比对照组增加0.34 倍，说明适度的超声波处理对芽苗的SOD活性有明显的提高作用；而2.5～7.5 mmol NaCl溶液处理下，SOD活性随着NaCl溶液的浓度增加而降低且均低于对照组(P<0.05)，说明NaCl胁迫对SOD活性有较强的抑制作用；苦荞麦经超声波协同NaCl处理下，SOD的活性随NaCl浓度的增加先升高后降低但均低于超声波处理组和对照组(P<0.05)。而在NaCl浓度及超声功率相同下，芽苗SOD活性随超声波处理时间的增加而增加，说明超声波处理有助于提高苦荞麦芽苗的SOD含量以缓解NaCl胁迫对芽苗的影响。超声波振动可以使细胞壁结构发生变化使酶从细胞壁内释放，达到促进生化代谢的目的。有研究证实超声波预处理有助于植物通过提高抗氧化酶活性来消除活性氧危害。

图3 超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗POD和SOD活性的影响

2.4 MDA和还原糖含量

超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗MDA和还原糖含量的影响如图4所示。从图4a可看出，超声波处理的苦荞麦芽苗的MDA含量均低于对照组；而NaCl溶液处理下的苦荞麦芽苗的MDA含量随NaCl浓度增加先升高后降低，T组处理的MDA含量最高，达到8.48±0.11 nmol/g，比对照组增加29.88%(P<0.05)，除此组外，其他NaCl处理组的MDA含量均低于对照组；超声波协同NaCl溶液处理时，在相同功率下(320 W)，MDA含量均低于对照组，且随超声处理时间延长而降低，T组处理MDA含量最低(5.62±0.02 nmol/g)，比对照组低13.93%(P<0.05)，说明超声波可减少MDA的生成且其降低量与超声波处理时间呈负相关。从图4b可看出，以240～320 W功率的超声波处理苦荞种子，芽苗中还原糖含量随功率增加而升高，T处理组最大，达11.25±0.09 mg/g，比对照组增加20.02%；2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液处理苦荞麦后，其芽苗还原糖含量随NaCl溶液浓度的增加而降低，T处理组最高，为12.85±0.28 mg/g，比对照组高37.09%，但各组均高于对照组(P<0.05)，说明NaCl胁迫对还原糖的增加有促进作用且随着NaCl浓度增加而逐渐减弱。超声波协同NaCl胁迫处理下，苦荞芽苗中还原糖的含量随着NaCl浓度增加而逐渐变弱，其中仅T组高于对照组。当NaCl浓度为5 mmol/L，超声波功率320 W时，随超声波处理时间的延长，芽苗中还原糖含量升高，但均低于对照组(P<0.05)，说明低浓度的NaCl胁迫，高功率长时间的超声波处理有助于还原糖含量的增加。

图4 超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗MDA和还原糖含量的影响

2.5 总酚和总黄酮含量

超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗中总酚和总黄酮含量的影响如图5所示。从图5a可看出，苦荞芽苗中总酚含量随超声波功率增加而升高，T处理最高，达2.75±0.03 mg/g，比对照组增加6.85%；而2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液处理的苦荞麦，其芽苗中总酚含量随NaCl浓度的增大而升高，但均低于对照组。超声波协同NaCl处理，其芽苗中总酚的含量均高于对照组，其中T处理的芽苗总酚含量最高，其含量为2.89±0.01 mg/g，比对照组增加9.63%。在相对NaCl浓度下，超声波协同NaCl胁迫处理的芽苗中总酚的含量要高于NaCl处理组(T)，说明超声波处理有助于提高芽苗中总酚含量而盐胁迫处理则呈抑制作用，且超声波处理有助于缓解NaCl胁迫处理对苦荞麦芽苗中总酚积累的负效应。但增加超声波处理时间其总酚含量呈降低趋势。

从图5b可看出，苦荞麦芽苗中总黄酮含量随超声波功率增加先升高后降低，T处理最高，为1.12±0.02 g/100 g，比对照组增加0.32倍，有报道证实超声波处理能够促进小麦幼苗的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性提高而增加黄酮类物质的含量。2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液处理后，苦荞芽苗中总黄酮含量随其浓度的增加而逐渐增加，T组最高，达1.09±0.02 g/100 g，比对照组增加0.29倍；超声波协同NaCl胁迫处理，苦荞芽苗中总黄酮含量显著高于对照组且随NaCl浓度增加而增加，T组最大，达1.37±0.02 g/100 g，比对照组增加0.61倍。当超声波功率为320 W，NaCl浓度为5 mmol/L时，随着超声处理时间的延长，总黄酮含量先升高后降低，T组最高，达1.71±0.03 g/100 g，比T组(5.0 mmol/L NaCl)和对照组分别增加0.21倍和1.01倍，说明超声波、NaCl胁迫及超声波协同NaCl胁迫均可促进苦荞中总黄酮含量的增加。

图5 超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗中总酚和总黄酮含量的影响

2.6 DPPH自由基清除能力

超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗DPPH清除能力的影响如图6所示。从图6可看出，芽苗对DPPH自由基的清除能力随超声波功率增加先增加后降低，T处理最高，达92.93±1.58%，高于对照组3.28%，说明适度的超声波处理有助于提高芽苗对DPPH自由基的清除能力；NaCl溶液处理下，其芽苗对DPPH自由基的清除能力随NaCl浓度的增大而降低，且均低于对照组，说明NaCl胁迫处理对芽苗对DPPH自由基的清除能力呈减弱作用；超声波协同NaCl处理下的苦荞麦，其芽苗对DPPH自由基的清除能力随NaCl浓度的增加先升高后降低，其中T组处理的芽苗对DPPH自由基的清除能力最高，达91.92±0.44%。在相对NaCl浓度下，超声波协同NaCl处理的芽苗对DPPH的清除能力要低于对照组但高于NaCl处理组(T)。而在相同的NaCl浓度及超声功率下，增加超声波处理时间，其芽苗对DPPH的自由基清除能力则先增加后降低，说明超声波处理有助于缓解NaCl胁迫处理对苦荞麦芽苗中DPPH的清除能力造成的负效应。超声波处理能够增强抗氧化酶活性从而提高种子的抗氧化能力从而抵抗不良环境。

图6 超声波协同NaCl胁迫对苦荞芽苗DPPH清除能力的影响

3 结论

适宜功率的超声波能在一定程度上促进苦荞麦种子萌发和生长。低浓度的NaCl溶液处理对苦荞麦种子初期的萌发、生长均有一定的促进作用，但高浓度对芽长和根长有抑制作用。超声波处理对NaCl胁迫下的苦荞萌发促进作用不显著。超声波处理可减少MDA的生成且其降低量与超声波处理时间呈负相关，苦荞芽苗中还原糖含量随超声波功率增加而升高，但随NaCl溶液浓度的增加而降低，但均高于对照组。适宜功率的超声波、低浓度NaCl溶液、超声波协同NaCl胁迫均有助于提高芽苗的POD活性。NaCl溶液处理会降低芽苗的SOD活性和总酚含量，但超声波处理有助于提高芽苗的SOD活性和总酚含量，并且缓解NaCl胁迫对SOD活性和总酚含量的积累造成的不利影响。低功率超声波处理及超声波协同NaCl胁迫处理均有助于增加总黄酮的含量和对DPPH自由基的清除能力。NaCl溶液处理显著促进黄酮含量的增加但降低对DPPH自由基的清除能力。