RPA-LFD技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的应用

鲁 瑶，赵丽丽，李马超，刘海灿，赵秀芹，刘志广，万康林，楼永良

利福平耐药结核病(Rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)是指患者感染的MTB对利福平耐药的结核病。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，2019年全球RR-TB新发病例大约46.5万例，其中78%为耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)，死亡人数约18.2万例，我国为MDR-TB高负担国家之一，占14%，居世界第二，而其治疗成功率仅为57%[1]。MDR-TB是指结核病患者感染的MTB至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病。研究表明RR-TB通常同时对异烟肼耐药[2-3]，并且结核分枝杆菌对利福平是否耐药也决定了临床上不同的治疗方案[4],所以对结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测意义重大。rpoB是利福平作用的靶基因，其作用机制是通过与RNA聚合酶β亚基结合，抑制细菌转录导致细菌死亡。在我国的结核病患者中，90%～95%的耐利福平结核分枝杆菌在rpoB中的利福平耐药决定区(即rpoB基因507-533位氨基酸密码子)存在突变[5]。已有不少研究表明，利福平耐药决定区中最常见的突变位点位于531、526、516位氨基酸密码子[6]。

用于检测基因突变的常规诊断技术大多以实时荧光定量PCR或DNA测序技术作为基础，这些方法不仅费时而且所需仪器设备要求高[7]。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种恒温扩增技术。它用大肠杆菌重组酶和单链结合蛋白替代了PCR中加热变性这一过程，用一种单链置换聚合酶替换了TaqDNA聚合酶，使扩增反应在37 ℃左右的恒温条件下就能进行[8]。本研究将该技术与侧流层析试纸条技术相结合，即在基于RPA反应设计的下游引物5′端标记羧基荧光素(FAM)，上游引物即探针的5′端标记生物素(Biotin)或地高辛(Dig)。若检测位点发生基因突变则RPA反应不能进行，若检测位点未发生突变，RPA反应顺利进行以形成双标记的RPA扩增产物，该产物可与层析液中的胶体金标记的FAM抗体结合，并被试纸条上的抗生物素抗体或抗地高辛抗体捕获以形成三明治样结构从而在试纸条上显现出肉眼可见条带。

本研究采用RPA-LFD技术对结核分枝杆菌中rpoB的531、526、516位氨基酸密码子进行突变检测，并把RRDR测序结果和RPA-LFD检测结果分别与比例法药敏试验进行比较，以评价该方法的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1菌株来源 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室保存的临床送检菌株(湖南62株，安徽120株)及结核分枝杆菌标准株(H37Rv，ATCC27294)。采用罗氏培养基进行传代培养后用于本研究。

1.2结核分枝杆菌比例法药物敏感性检测 对182株临床分离株进行药物敏感性检测。实验操作遵循《结核病诊断实验室检验规程》进行,利福平在含药培养基中的浓度为40.0 μg/mL[9]。

1.3DNA的提取 将结核分枝杆菌标准株和临床分离株接种到罗氏培养基上，37 ℃培养2～3周，有可见菌落生长后刮取一接种环菌落置于装有1 mL无菌水的螺口管中，80 ℃水浴加热30 min灭活后，12 000 r/min离心5 min，尽量吸净上清后加入1 mL无菌水，吹打混匀，12 000 r/min离心5 min，尽量吸净上清后加入150 μL无菌水，100 ℃加热20 min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清待用。

1.4rpoB利福平耐药决定区基因扩增及突变分析 上游引物：5′-CTTGCACGAGGGTCAGACCA-3′；下游引物：5′-ATCTCGTCGCTAACCACGCC-3′。扩增体系(30 μL)：2×Taq master mix(TaKaRa)15 μL，引物(5 μmol/L)各1 μL，DNA样品1 μL及水12 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min[10]。将PCR扩增产物进行DNA测序分析，引物合成和测序工作均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。DNA测序结果与GenBank上公布的结核分枝杆菌H37Rv标准株对应基因序列进行比对分析，获得每株菌在利福平耐药决定区的突变特征。

1.5RPA-LFD的引物探针筛选 根据GenBank公布的结核分枝杆菌rpoB基因的DNA序列，设计检测rpoB中531、526、516位密码子的3条上游引物即探针(rpoB-531、rpoB-526、rpoB-516)和1条下游引物rpoB-A。RPA的引物设计不同于普通PCR，有其特殊的设计原则。另外，对设计的引物和探针还应进行优化。表1中的引物和探针均为优化后的产物。

1.6RPA-LFD反应分析利福平耐药性 RPA反应试剂盒：安普未来DNA恒温快速扩增试剂盒基础型(MIRA)。LFD试剂盒：Milenia GenLine HybriDetect(GieBen, Germany)。在普通PCR反应管中配制RPA反应体系(表2)。经短暂离心后加入MIRA反应管，同时在管盖中加入2.5 μL Buffer B，盖上管盖后用手指弹打MIRA反应管直到管内液体与冻干粉充分混匀。最后通过离心甩下管盖中Buffer B启动反应，39 ℃金属浴反应10 min。反应结束后在1.5 mL EP管中加入48 μL RPA-Laufbuffer，再加入2 μL RPA反应产物稀释25倍。吹打混匀后吸取10 μL稀释液加到试纸条上。另取一个EP管加入90 μL RPA-Laufbuffer，将试纸条插入该EP管，待反应4 min左右读取结果。

表2 RPA反应体系

1.7统计学处理 应用SPSS 24.0统计软件进行统计分析，以传统药敏试验结果为金标准，分别计算RPA-LFD和DNA测序技术的检测效率，用Kappa检测来分析两种结果的一致性。Kappa<0.4时为低度一致性；0.75≥Kappa≥0.4时为中度一致性；1.0≥Kappa>0.75时为高度一致性。

2 结 果

2.1比例法药敏实验结果 比例法药敏试验结果显示，182株临床分离菌中有125株敏感菌，57株耐药菌。

2.2rpoB基因利福平耐药决定区测序结果 182株临床菌株中，130株菌在RRDR中未发生突变，其中125株为比例法药敏试验敏感株，5株为比例法药敏试验耐药株。52株菌在RRDR中存在突变，且比例法药敏试验结果都为耐药株。检测到的突变株的突变类型及对应突变株数量见表3。

表3 RRDR突变位点分析结果

2.3RPA-LFD检测结核分枝杆菌RRDR突变结果 采用RPA-LFD方法共检测182株临床分离株，其中33株菌检出531位密码子突变，包括31株TCG531TTG突变菌株、2株TCG531TTT突变菌株。11株菌检出526位密码子突变，包括2株CAC526CGC突变菌株、1株CAC526AAC突变菌株、1株CAC526CCC突变菌株、1株CAC526TGC突变菌株、1株CAC526CTC突变菌株、2株CAC526GAC突变菌株、3株CAC526TAC突变菌株。4株菌检出516位密码子突变，包括3株GAC516GTC突变菌株、1株GAC516GGC突变菌株。图1为代表各种突变类型菌株的检测结果。

A: 1.H37Rv; 2.531 codon, TCG-TTG; 3.531 codon, TCG-TTT; 4.blank control；B: 1.H37Rv; 2.516 codon, GAC-GTC; 3.516 codon, GAC-GGC; 4.526 codon, CAC-CGC；5.526 codon, CAC-AAC; 6.526 codon, CAC-CCC; 7.526 codon, CAC-TGC; 8.526 codon, CAC-CTC; 9.526 codon, CAC-GAC; 10.526 codon, CAC-TAC; 11.blank control

2.4RPA-LFD和DNA测序技术的检测效率 以传统比例法药敏试验结果为金标准。RPA-LFD检测结果显示：检出48株突变株，均为耐药株。检出134株未发生突变，其中125株为敏感株，9株为耐药株。以比例法为金标准，RPA-LFD的灵敏度为84.2%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为93.3%，Kappa值为0.880，说明两种检测方法的检测结果具有高度一致性。同样以比例法为金标准，在利福平耐药菌株中，发生RRDR突变的菌株占91.2%，未发生RRDR突变的菌株占8.8%。即用DNA测序法检测利福平耐药性的灵敏度为91.2%，特异度为100%,阳性预测值为100%，阴性预测值为96.2%，Kappa值为0.935(表4)，故而可认为两种检测方法的检测结果具有高度一致性。

表4 RPA-LFD和DNA测序检测利福平耐药的效率

2.5分析RPA-LFD的检测时间 对于培养物核酸检测，RPA反应只需10 min，LFD检测也仅需4 min左右即可判读检测结果，整个实验过程不足20 min即可完成，满足了结核分枝杆菌RRDR常见突变位点快速检测之需求。

3 讨 论

全球约30%的人口受到结核病危害。耐多药结核病已成为控制结核病传播的主要障碍，如何快速诊断耐多药结核病对全球结核病防治工作至关重要[11]。虽然在分子诊断领域，我们已经在结核病的诊断和耐药性检测上取得了公认的进步，如XpertMTB/RIF系列技术、线性探针技术、全基因组测序技术、基因芯片技术以及可供实验室使用的基于核酸扩增技术的一系列商品化试剂盒[12]，但这些技术对设备和操作人员的技术要求高且耗时长。WHO建议发展中国家必须采用更加快速的分子诊断技术去检测耐药结核分枝杆菌[1]。RPA作为一种恒温扩增技术，它不仅具有其他核酸扩增技术共有的高灵敏度、高特异度的特点；同时还具备低温扩增、操作简单、耗时短、对设备依赖性较低的优点，可用于偏远地区传染性疾病的快速诊断和床旁检测技术的开发。RPA-LFD为结核病的实验室诊断和耐药检测开拓了新的途径,更满足了当前临床快速检测之需求。

由于单耐利福平结核分枝杆菌较少，对利福平耐药的结核分枝杆菌通常伴随其他药物耐药，最常见的就是异烟肼，据世卫组织统计该比例高达78%[1]。这使得利福平耐药相关位点成为了诊断MDR-TB的主要参考标志物[13]。本研究以rpoB中531、526、516位氨基酸密码子为靶标设计了3条探针和1条通用下游引物，运用RPA-LFD技术检测结核分枝杆菌在这3个位点上是否存在突变。研究结果显示以比例法为金标准，RPA-LFD检测结核分枝杆菌利福平耐药性的特异度高达100.0%，灵敏度为84.2%。DNA测序技术不仅显示出100.0%的特异度，灵敏度也达到了91.2%。RPA-LFD的灵敏度低于DNA测序技术，主要是因为新建立的RPA-LFD技术只能检测RRDR中531、516、526位密码子的突变，而利福平耐药的临床菌株中还存在其他位点如522、533位密码子的突变。另外，本研究建立的RPA-LFD技术可检测出2种531位密码子突变类型、2种516位密码子突变类型、7种526位密码子突变类型，提示其可以检测的突变类型种类多，涵盖了本实验182株临床株中通过DNA测序可检测到的所有突变类型。参考对利福平耐药菌株rpoB基因突变类型的研究[14-15]，表明本研究已检测的突变类型占该3个位点所有突变类型的95%以上。本研究建立并评估了一种简便快速的用于检测结核分枝杆菌利福平耐药的方法，通过对RRDR中531、526、516位氨基酸密码子的突变检测来判断结核分枝杆菌利福平耐药特征。该方法具有以下优点：①39 ℃恒温反应，只需一台金属浴就可完成反应；②检测时间短，RPA反应只需10 min,LFD在4 min左右就可观察结果；③操作简单，检测结果可直接肉眼观察且无需特殊的检测设备。当然该方法也有不足之处：①当进行试纸条检测时需要打开反应管，容易产生气溶胶对下一次反应产生污染，因此应在通风良好处进行实验或分区操作；②本技术仅能检测利福平耐药常见的531、526和516位点的突变，因此不能替代常规的药敏实验，尤其对于阴性结果须进一步验证。本研究作为一个初步研究，后续将进一步扩大临床样本检测数，针对更多的耐药相关突变位点设计探针，并且尝试直接从痰标本中提取DNA进行RPA-LFD检测，以求进一步提高RPA-LFD对结核分枝杆菌耐药性的临床检测性能和检测速度。

利益冲突：无