不同时间低压低氧刺激对大鼠肺动脉压力及肺组织的影响

邓 会 王 勇 陈小兰 秦 崇 潘 磊*

(1. 首都医科大学附属北京世纪坛医院呼吸与危重症医学科低压低氧实验室,北京 100038； 2. 北京急救中心， 北京 100031)

我国幅员辽阔、地形复杂，拥有海拔最高的青藏高原、内蒙古高原等四大高原。随着海拔升高，空气压力逐渐下降，不同的地区和海拔的空气中氧气含量也不同[1]，氧气分压也会随高度升高而下降，导致高海拔地区出现低压低氧环境[2-3]。突然暴露于高原的低压低氧环境可能会发生急性高原反应，严重者可发展为急性脑水肿或急性肺水肿[4-5]，长期暴露于低压低氧环境可导致慢性高原病，如肺动脉高压[6-7]等。低氧环境可以刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)的产生，从而促进肺小血管平滑肌细胞、内皮细胞增殖、分化，大量炎症细胞释放炎症因子等，最终导致肺动脉高压[8]。目前大约超过1.4亿人永久居住在海拔2 500米以上的地方，每年有超过3 500万人前往高海拔地区，包括军队、救援人员、铁路工作人员等[7]，因此了解间断及持续低压低氧环境对机体的影响至关重要。前期本课题组模拟高原的特殊环境，已经成功建造了低压低氧肺动脉高压大鼠模型[9-11]。本文旨在观察不同低压低氧刺激时间对大鼠平均肺动脉压力、肺组织及酪氨酸激酶中VEGF、PDGF、FGF表达水平的影响，以期为更合理的高原工作时间安排提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究采用Sprague Dawley雄性大鼠，8周龄，体质量约280～320 g，SPF级，共计32只，订购于北京市维通利华实验动物技术有限公司。大鼠VEGF ELISA检测试剂盒，PDGF ELISA检测试剂盒，FGF ELISA检测试剂盒均购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1)利用低压低氧舱构建肺动脉高压大鼠模型：将32只健康雄性SD大鼠采用抽签法随机分为4组：A组正常海拔环境下饲养21 d，B组持续低压低氧环境21 d，C组每天6 h低压低氧环境持续21 d，D组隔天24 h低压低氧环境21 d。先于常压常氧下适应性喂养3 d后开始实验。持续低压低氧条件为：低压低氧舱内持续减压到模拟海拔5 000米(条件为大气压约50 kPa，氧浓度10%)，舱内温度、湿度、照明与外界环境相同，每天开舱1 h更换垫料及补充食水。

2) 肺循环血流动力学测定:采用右心导管检查的方法测定大鼠肺循环血流动力学的参数。各组 SD 大鼠饲养到规定时间，用戊巴比妥钠( 40 mg /kg) 腹腔注射麻醉，仰卧固定、右侧颈部备皮、消毒、切开，分离右颈外静脉，插入充有 1 mg/mL肝素[0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)]的聚乙烯PE-50右心导管，导管的另一端与 BL-420S 生物信号采集系统(成都泰盟)相连，在压力波形的引导下，导管经上腔静脉进入右心房、三尖瓣口、右心室，最后进入肺动脉干，监测压力变化，并进行采集和记录。

3)HE染色：分离大鼠左肺下叶组织块, 常规石蜡包埋, 连续切片(厚5 μm)，将部分切片进行HE染色后光镜观察。

4)指标检测：采用ELISA(酶联免疫吸附法)检测大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同低压低氧处理时间对大鼠肺动脉压力的影响

B、C、D组大鼠平均肺动脉压力较A组大鼠肺动脉平均压力升高(P<0.05)，其中B组升高最为明显，平均肺动脉压力为(27.4±1.2) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。C组和D组平均肺动脉压力较A组有升高但是均小于25 mmHg，详见表1。肺动脉压力波形图如图1。

图1 通过 BL-420S 生物压力传感器测定大鼠肺动脉压力采集图形Fig.1 The pulmonary artery pressure of rats was measured by BL-420S pressure sensor △1mmHg=0.133 kPa.

表1 通过右心导管法测定大鼠平均肺动脉压力的数值

2.2 4组大鼠肺组织HE染色

与A组相比，B组大鼠肺血管周围可见淋巴细胞浸润，可见肺组织局部实变，亦可见部分肺泡过度充气；C组少量肺血管周围可见淋巴细胞浸润，未见明显肺组织实变或过度充气；D组肺血管可见淋巴细胞浸润，肺组织局部实变。B组肺组织病变较C组和D组明显(图2)。

图2 4组大鼠肺组织病理图Fig. 2 Pathological changes of lung tissue in four group rats(HE staining,100×) Lymphocyte infiltration can be seen at the black arrow; The yellow triangle was the consolidation lung tissue; The red triangle area was alveolar hyperinflation (the focus of various pathological changes was selected in the visual field);A: Group A; B: Group B; C: Group C; D: Group D.

2.3 4组大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表达量比较

与A组相比，B、C、D组大鼠的VEGF、PDGF、FGF表达量均会出现升高,差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 不同低压低氧处理时间大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表达量

3 讨论

随着高原铁路的修建及旅游业发展，越来越多的人生活或工作在高海拔地区(低压低氧环境)，了解急性或慢性高原病的发生机制及如何更好地适应高原环境对避免急性及慢性高原病的发生具有重要意义。高原的低压低氧环境可使肺血管内皮细胞功能、代谢和结构发生改变[12]，促使肺血管收缩、重塑，导致肺小动脉产生功能及器质性病变，最终导致肺动脉压力升高。肺血管重塑不仅表现为肺动脉壁(肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和周细胞)中不同血管细胞的增殖，还表现为毛细血管的丢失和血管周围过度浸润炎性细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞、树突状细胞、巨噬细胞等)[13]。既往本团队成功建立了低压低氧肺动脉高压动物模型[9-11]，并且发现低压低氧肺动脉高压模型大鼠肺组织可见动脉管壁的增厚、平滑肌细胞增生、炎症细胞浸润等[14]。本实验研究探索了不同低压低氧处理时间肺组织内炎性细胞的浸润，肺泡结构的破坏，部分肺血管壁增粗，肺动脉压力升高情况，为间歇性低压低氧刺激下肺动脉压力及肺组织变化提供了理论依据。但由于实验动物数量较少，测量肺动脉压力操作技术等多种因素影响，可能会造成一定的实验误差。

刺激血管生成的细胞因子包括直接和间接促血管生成。直接促血管生成标志物包括VEGF、FGF和肝细胞生长因子(hepatocyte grouth factor,HGF)，而间接促血管生成标志物包括生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-8和PDGF,VEGF和FGF是血管生成的最强激活因子，可促进血管内皮细胞的迁移和增殖，从而产生和稳定新生血管[8]。研究[15-16]表明，VEGF促进细胞分裂增殖，在各种肺疾病尤其是急性呼吸窘迫综合征的患者血浆中含量增加。FGF在正常人中有重要的生理功能，如促进伤口愈合、胚胎发育等，但是FGF的过度表达导致血管的异常增殖[17]。有研究[18]曾在肺动脉高压患儿重塑的肺小动脉上检测出VEGF和FGF的过度表达。PDGF是一种有效的有丝分裂原，对血管壁细胞如平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)具有较强的趋化作用[19]。PDGF信号转导增加可能参与肺动脉高压的病理生理学过程[20-21]。既往也有研究[22]表明，FGF和VEGF在低压低氧环境下表达升高并且与低压低氧持续刺激时间有关。本实验也显示，在受到低压低氧环境刺激后，VEGF、FGF、PDGF表达量升高，且与平均肺动脉压力成正比，在今后的实验中会进一步延长实验周期，观察三者动态变化及肺动脉压力的改变，并且将从细胞水平上观察肺组织及肺血管的改变。

目前关于长期间断性往返高原环境工作的人群所发生的病理生理改变的研究甚少, 近年才开始关注这一特殊人群的健康问题[23]。本实验模拟海拔5 000 m 高度，对不同低压低氧时间大鼠的平均肺动脉压力、肺组织改变及血清中VEGF、FGF、PDGF表达量进行探讨，结果显示，每天间断低压低氧刺激6 h对大鼠肺动脉压力及肺组织影响较小，但是仍可见大鼠肺血管周围有淋巴细胞浸润，说明诱发了肺内炎症反应；间断低压低氧24 h的大鼠平均肺动脉压力升高及肺组织改变较前者明显，但是两者并未到达肺动脉高压的诊断标准。血清中VEGF、FGF、PDGF表达量与低压低氧刺激时间呈正相关，间断低压低氧刺激后肺内炎症改变及大鼠平均肺动脉压力改变是否可逆，在今后的实验中笔者会进一步探究，同时也将适当延长实验周期观察上述指标的动态变化。该实验模拟间断低压低氧环境刺激，通过不同时长的低压低氧刺激观察大鼠一些病理生理指标改变，以期为保证高原作业人员这一特殊人群的身体健康状况，为设立适当的工作期限或轮班制度提供理论依据。