肝细胞条件性Eva1a/Tmem166基因敲除小鼠的表型分析

陈建宏 林 欣 冯金秋 丁鹏鹏 王苗苗 林 琳 刘 红* 吴 静

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科，北京 100038； 2.北京大学人类疾病基因研究中心，北京 100083； 3.首都医科大学附属北京友谊医院消化内科 国家消化系统疾病临床医学研究中心 北京市消化疾病中心 消化疾病癌前病变北京市重点实验室，北京 100050)

细胞自噬是进化保守的对细胞内物质进行降解和再循环的重要过程，是一种基本的细胞应激调控机制[1]。自噬调控的异常参与肿瘤、神经退行性疾病、肝脏疾病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、感染及自身免疫疾病等的发生、发展[2]。细胞自噬可通过多种途径调节脂质代谢、胰岛素抵抗、氧化应激、肝细胞损伤等，与非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发生、发展密切相关[3-4]。

Eva1a(eva-1 homolog A)，也称为Tmem166 (transmembrane protein 166)，是具有自噬和凋亡双调控作用的人类新分子[5],该基因进化保守，在人体多种正常组织呈现高表达，在癌症组织中表达下调[6]。体内外研究发现Eva1a能够诱导肿瘤细胞发生自噬和凋亡，抑制肿瘤细胞的生长[7]。分子机制研究[8]表明，Eva1a能够定位于自噬体膜，与自噬关键分子(autophagy related protein 16 like protein 1,ATG16L1)相互作用，在ATG12-ATG5/ATG16L1介导隔离膜延伸中发挥重要作用。小鼠的神经干细胞特异敲除Eva1a可通过抑制自噬，从而抑制神经干细胞的自我复制及分化[9]。Eva1a在心肌细胞的特异敲除，导致自噬受损和凋亡增加，加重心肌纤维化及心肌重塑[10]。

Eva1a在肝脏中高表达，Lu等[11]研究证明C/EBPalpha 诱导的肝癌细胞自噬依赖于Eva1a的参与，Ren等[12]的研究显示microRNA-125b 可以通过调控Eva1a诱导的自噬逆转肝癌细胞对奥沙利铂的耐药性，最近的研究[13]显示在肝细胞中灭活Eva1a能够加重急性肝损伤。本研究构建了肝细胞Eva1a基因条件性敲除的小鼠模型，分析了该基因敲除对小鼠生理状态下体质量、肝脏外观与组织结构、肝指数、肝功能、糖脂代谢以及细胞自噬等表型的影响，为进一步研究Eva1a在NAFLD等肝脏疾病发生中的作用及分子机制提供了动物模型。

1 材料与方法

1.1 肝细胞条件性 Eva1a基因敲除小鼠的繁殖

以C57BL/6 为遗传背景的Eva1a条件性基因敲除小鼠(Eva1aflox /+)由南京大学模式动物研究所构建，鼠肝细胞中表达Cre重组酶的Alb-Cre小鼠作为工具鼠，购自上海南方模式生物科技股份有限公司。

将Eva1aflox /+小鼠与Alb-Cre小鼠杂交，选取后代为Eva1aflox /+:Alb-Cre基因型的小鼠。Eva1aflox /+:Alb-Cre小鼠之间交配，选取后代为Eva1aflox/flox和Eva1aflox/flox:Alb-Cre基因型的小鼠。后续繁殖均为Eva1aflox/flox和Eva1aflox/flox:Alb-Cre交配，选取同窝Eva1aflox/flox为对照组，Eva1aflox/flox:Alb-Cre为肝细胞条件性Eva1a基因敲除小鼠进行后续的研究[13]。

小鼠饲养繁殖于北京大学医学部，符合SPF级动物饲养标准级动物饲养标准。动物房温度21 ℃，光-暗周期为12 h。所有小鼠自由采食和饮水，小鼠饲料、饮水、垫料均经高温高压灭菌处理。实验所使用的所有动物均经过北京大学医学部伦理委员会批准，实验过程中对小鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》相关规定进行。

1.2 生长发育检测

雌雄纯合肝细胞条件性Eva1a基因敲除小鼠进行交配，观察有无胚胎期致死现象。选取对照组与实验组小鼠每组雌雄各5只，连续13个月监测小鼠体质量，每个月称量1次，雌雄分别统计。13个月后处死小鼠，称取体质量。取血清以及肝脏，观察肝脏外观差异。肝脏称质量，测量肝指数。

1.3 血清学检测

分别检测雌雄小鼠随机血糖和空腹血糖，检测血清中总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)浓度，评估Eva1a基因肝细胞条件性敲除对糖脂代谢的影响。检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)浓度评估Eva1a基因敲除对肝细胞功能的影响。检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所以及北京普利莱基因技术有限公司的商品化试剂盒。

1.4 肝脏石蜡切片的制作以及组织学检测

按照实验室常规制作肝脏组织石蜡切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色检测肝脏组织结构；过碘酸希夫(periodic acid-schiff, PAS)染色检测肝脏组织糖原分布；天狼星红(Sirus red)染色检测肝脏纤维化。

1.5 组织总蛋白提取和 Western blotting分析

在装有肝组织的1.5 mL匀浆管中加入500 μL组织裂解液(RIPA内含蛋白酶和磷酸酶抑制剂Cocktail)匀浆2～3次，上清转入新1.5 mL离心管，冰上放置30 min，4 ℃，16 000 r/min离心15 min，上清转入新1.5 mL离心管并进行蛋白定量，每组蛋白取100～200 μg，加入蛋白上样缓冲液，95 ℃煮10 min，进行15%(质量分数) SDS-丙烯酰胺胶电泳、转膜、5%(质量分数)脱脂奶粉封闭；加入相应的一抗4 ℃过夜，TBST充分洗膜3次，然后加入相应的DyLight 680/800标记的二抗，室温避光反应2 h，)TBST洗膜后使用Odyssey Infrared Imager仪器检测信号。

1.6 组织RNA提取及反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)分析

取黄豆粒大小的小鼠组织放入1.5 mL匀浆管中，加入1 mL TRIzol，按照常规方法提取RNA，用反转录试剂盒合成cDNA 文库，RT-PCR检测Eva1a基因mRNA表达，以Eva1a-F：5′-GCCGCTCTGTACTTTGTC-3′和Eva1a-R：5′- TCTCCCTG ATCATTCGTT -3′为引物，扩增条件为95 ℃ 5 min→ 95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，扩增 25～35个循环→72 ℃ 7 min，PCR产物进行琼脂糖电泳并分析，GAPDH为内参。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 统计软件对数据进行处理分析。Eva1a-/-和Eva1a+/+小鼠体质量变化和血清ALT、AST浓度变化采用双因素重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD方法。实验组与对照组小鼠肝指数、随机血糖、空腹血糖和脂代谢指标浓度比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞条件性 Eva1a基因敲除小鼠的鉴定

RT-PCR检测Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠肝脏、脑、心脏组织Eva1a基因mRNA表达，在Eva1a-/-小鼠肝脏中几乎检测不到Eva1a基因mRNA的表达，而在脑和心脏组织中Eva1a基因mRNA的表达没有明显变化(图1A)。Western blotting法检测小鼠肝组织Eva1a蛋白的表达，在Eva1a-/-小鼠肝脏中几乎检测不到Eva1a蛋白的表达(图1B)。

图1 肝细胞条件性 Eva1a基因敲除小鼠的鉴定Fig. 1 Identification of hepatocyte-specific Eva1a gene knockout miceA: Eva1a mRNA was examined by RT-PCR; B: Eva1a protein was examined by Western blotting; RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction.

2.2 肝细胞 Eva1a敲除对生理状态下小鼠生长发育的影响

对肝细胞Eva1a敲除小鼠和野生型小鼠的长期观察发现，Eva1a+/+与Eva1a-/-雄鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05)，Eva1a-/-雌鼠的体质量较Eva1a+/+有所升高。在13个月后处死小鼠，发现无论雄性小鼠还是雌性小鼠，Eva1a+/+与Eva1a-/-肝脏的外观并无明显异常。测量肝指数发现Eva1a-/-雌鼠肝指数显著降低(图2)。

图2 Eva1a+/+与 Eva1a-/-小鼠生长监测Fig.2 Growth monitoring of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: weight monitoring of male; B: weight monitoring of female; C: liver appearance; D: liver index; **P<0.001.

2.3 Eva1a敲除对小鼠肝功能及糖脂代谢指标的影响

在2个月、5个月和1年的Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠血清中ALT、AST浓度均在正常范围内，差异无统计学意义(P>0.05)。Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠的随机血糖和空腹血糖比较，两组小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。同时，检测了小鼠的血清中脂质代谢指标，血清中总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯、三酰甘油、HDL-C和LDL-C浓度均在正常范围内，差异无统计学意义(图3)。

图3 Eva1a+/+与 Eva1a-/-小鼠肝功能及糖脂代谢指标检测Fig.3 Liver function, blood glucose and lipid detection of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: ALT; B: AST; C: blood glucose; D: fasting blood glucose; E: total cholesterol; F: free cholesterol; G: cholesteryl ester; H: triglyceride; I: HDL-C; J: LDL-C; ALT: alanine aminotransferase; AST： aspartate aminotransferase; HDL-C： high density lipoprotein cholesterol; LDL-C： low density lipoprotein cholesterol.

2.4 Eva1a敲除对小鼠肝组织结构、糖原以及胶原纤维分布的影响

对Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠肝脏的HE 染色发现，两组小鼠肝脏组织结构均无明显异常。PAS 染色主要用于检测组织中的糖类，Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠糖原分布无明显差异。天狼星红染色可以将胶原染色结果发现Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠肝脏组织胶原纤维无显著异常(图4)。

2.5 Eva1a敲除对小鼠肝细胞自噬的影响

Western blotting实验结果表明，与Eva1a+/+小鼠相比较，Eva1a-/-小鼠的LC3略有下调，SQSTM1/P62蛋白无明显差异。发现无论MTOR信号通路以及LKB/AMPK信号，Eva1a+/+与Eva1a-/-小鼠均无明显异常，在正常饲养条件下，Eva1a-/-小鼠的自噬没有明显的改变(图5)。

图5 Eva1a+/+与 Eva1a-/-小鼠肝组织自噬表型以及信号通路Fig.5 Autophagy phenotype and signal pathway detection of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: LC3B and SQSTM1 detection by Western blotting; B: LKB/AMPK protein detection; C: MTOR/RPS6KB1/ PRS6 protein detection.

3 讨论

Eva1a是北京大学人类疾病基因研究中心首次报道的与自噬与凋亡相关基因。分子机制的研究[8]证明Eva1a可以通过 C 端 与 ATG16L1 的 WD 结构域相互作用，促进自噬体的形成。进一步的研究[9-10]发现Eva1a在脑中能促进神经干细胞的生长和分化，促进神经系统的发育[9]，在心脏中能影响心肌重塑[10]。最新研究[12]显示Eva1a诱导的自噬在肝癌细胞的耐药过程中发挥了重要作用。Eva1a在肝脏中高表达，本研究分析了Eva1a肝细胞条件性敲除对生理状态下小鼠生长发育、肝功能、糖脂代谢、肝脏组织结构、及自噬方面的影响，结果显示Eva1a基因敲除小鼠在体质量、行为、血清学指标、肝脏组织结构方面无明显异常，Eva1a敲除对小鼠肝细胞自噬无显著影响，这提示Eva1a可能对于肝脏的发育及功能不是必要的。 这与部分关键的自噬相关基因不同，例如Atg5、Atg7敲除小鼠肝脏会自发形成肿瘤[14]，Vps34以及Rack1肝敲除小鼠出现肝脏肿胀[15]。Eva1a敲除对于肝脏基础的自噬没有明显影响，这可能是由于Eva1a并不是自噬过程不可缺少的基因，可能起到辅助作用。

mTOR 通路是自噬调控中非常重要的信号通路。mTOR 通路的激活能抑制自噬， 其下游底物RPS6KB1-RPS6 能促进蛋白质合成。而mTOR上游通路包括PIK3C3/AKT和LKB1/AMPK等，能通过影响 mTOR 通路影响自噬。前期研究[7]表明Eva1a可能通过抑制mTOR信号通路促进自噬发生，而Eva1a敲除会通过Pik3c3-Akt-mTOR 通路影响神经系统发育[9]，通过 mTOR 通路影响心肌重塑[10]，因此本研究在肝组织中检测了相关信号分子的表达, Western blotting 实验结果表明，在正常饲养条件下，灭活Eva1a的小鼠肝细胞LKB1/AMPK以及mTOR通路相应分子的磷酸化水平没有明显变化。与在脑和心脏的结果并不一致，也许是不同的组织或细胞的反应不同所致。

随着肥胖和代谢综合征的流行，NAFLD 已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生物化学指标异常的首要原因。NAFLD 的发病机制复杂，现在多认同Day 和James 提出的“二次打击”学说，即第一次打击为高胰岛素血症和胰岛素抵抗引起单纯肝细胞脂肪变性；第二次打击为氧化应激和脂质过氧化、炎性细胞因子释放、线粒体功能障碍等因素诱导肝脏炎性反应、肝细胞变性坏死和肝纤维化、肝硬化的发生[4]。自噬在脂质过氧化、氧化应激及炎性反应等应激状态中起到重要的调控作用[3,16]。高脂饮食可能通过PI3K-AKT 通路激活mTOR，激活的mTOR 导致TFEB 磷酸化后无法进入细胞核调控自噬及溶酶体基因的表达，降低肝细胞的自噬，抑制了脂滴的降解[4, 17-18]，导致NAFLD的发生。生理状态下Eva1a的功能可能会在胚胎发育过程中被其他基因代偿，然而在应激状态下，基因功能的缺失可能无法被完全代偿，在接下来的工作中，将在Eva1a肝细胞条件性敲除鼠中通过高脂饮食诱导NAFLD模型，进一步探讨应激状态下Eva1a在NAFLD发生中的作用及分子机制。