姜黄素抑制肺癌A549细胞迁移能力的机制研究

乔 曼，李冬生，何 媛,张 岑，李晓秋，李少颖

姜黄素是姜黄根茎植物中最重要的亮黄色多酚成分之一，临床广泛用于咳嗽、鼻窦炎、哮喘、风湿病、糖尿病及心血管疾病等的治疗[1-2]。近年来发现，姜黄素具有抗肿瘤作用，其机制尚未完全阐明，主要与抑制增殖、诱导凋亡、DNA甲基化及抑制血管生成等有关[3-5]。癌细胞转移是癌症高病死率和复发率的重要原因，与表皮间质转化(EMT)等多种原因有关，如何抑制癌细胞转移是癌症研究的热点问题。研究表明，姜黄素有抑制肺癌细胞侵袭的作用，其机制可能与抑制TGF-β介导的EMT有关[6]，但具体机制尚未完全阐明。SRPK1是一种丝氨酸/精氨酸蛋白激酶，能够磷酸化蛋白质的丝氨酸/精氨酸残基，与肺癌转移有关[7]。姜黄素抑制肺癌细胞转移是否与SRPK1相关尚未明确，故本研究对此展开研究。

1 材料与方法

1.1细胞培养和试剂 肺癌A549细胞购自上海酶研生物科技有限公司；姜黄素购自美国Sigma公司，批号:C1386-10G；RPMI 1640培养基和胰蛋白酶购自Gibco公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；标准胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;Taq DNA聚合酶购自美国MBI公司;逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，批号：998897;质粒提取试剂盒购自Vigrous公司。SRPK1抗体(ab90527)、TGF-β1抗体(ab92486)、ZEB1抗体(ab203829)、TWIST1抗体(ab50887)和SNAIL抗体(ab229701)均购自美国Abcam公司。

肺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中孵育,待细胞长满培养瓶80%时用胰蛋白酶消化、计数、传代。

1.2SRPK1减低肺癌A549细胞系的构建 通过检索NCBI Gene Bank数据库，获取SRPK1 RNA的完全序列，选择编码区作为设计siRNA的靶序列。利用Ambion公司的在线工具，找出具有siRNA功能的靶序列及能编码siRNA的对应DNA序列。把该DNA序列送往Invitrogen公司合成，并得到含有siRNA的psilencer TM 3.1-H1 hygro载体质粒。将该质粒转染至肺癌A549细胞，并筛选出稳定表达的细胞株。

1.3细胞迁移实验检测姜黄素对肺癌A549细胞迁移的影响 先用marker笔在6孔板背后画横线，用直尺每隔0.5～1.0 cm画一横线，穿过孔，每孔至少穿过5条横线。将20 μg/ml姜黄素处理的A549细胞和未处理的A549细胞加入6孔板中，每孔约5×105个细胞，置于37℃培养箱中培养。第2日用10 μl枪头画与标记线垂直方向的2条平行线，后用PBS液洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养，0、6、12、24 h后用倒置显微镜观察并拍照。

1.4Western blot法检测SRPK1、SNAIL、TGF-β、TWIST1和ZEB1蛋白的表达 取对数生长期A549细胞，实验组加入20 μg/ml姜黄素，对照组加入等量DMSO。2组细胞同时在37℃、5% CO2环境中培养24 h后提取蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，利用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入对应一抗4℃孵育过夜，PBST洗涤3次;加入HRP标记的二抗(稀释倍数1︰200)，室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL发光剂显影，通过凝胶成像系统获得清晰条带。计算目的基因/β-actin的灰度比值。

1.5RT-PCR检测SRPK1、SNAIL、TGF-β、TWIST1和ZEB1 mRNA的表达 采用Trizol法提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA,每个样本分别用各目的基因和内参基因引物扩增，设3个平行重复实验,各取5 μl反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳，应用Fluorchen 2.01软件进行分析，计算各组目的基因/β-actin的灰度比值。相关基因引物序列见表1。

表1 RT-PCR基因引物序列

2 结果

2.1姜黄素对A549细胞迁移能力的影响 姜黄素处理后，A549细胞迁移能力显著下调，见图1。

图1 姜黄素对A549细胞迁移能力的影响

2.2SRPK1对A549细胞迁移能力的影响 我们之前的研究表明，A549细胞SRPK1表达量较正常肺上皮细胞显著上调[8]。本研究中，与对照组相比，实验组癌细胞转移相关基因SNAIL、TGF-β、TWIST1及ZEB1的蛋白和mRNA表达均显著下调；用siRNA下调A549细胞SRPK1表达后，上述转移相关基因蛋白和mRNA表达均明显下调。提示SRPK1具有调控细胞迁移的作用；在正常肺上皮细胞中导入SRPK1质粒，上述转移相关基因蛋白和mRNA表达明显升高，进一步验证了SRPK1对细胞迁移的调控作用。见图2。

图2 姜黄素对A549细胞迁移相关基因蛋白和mRNA表达的影响

2.3姜黄素下调A549细胞SRPK1蛋白和mRNA的表达 添加姜黄素后A549细胞SRPK1蛋白和mRNA表达显著下调(P<0.01)。见图3。

图3 姜黄素下调A549细胞SRPK1蛋白和mRNA的表达

3 讨论

研究表明，姜黄素可通过多种途径抑制癌细胞的转移[9-11]。徐炜等[12]研究表明，姜黄素可以通过下调LIMK-1/cofilin蛋白磷酸化水平来影响细胞内微丝骨架的结构和分布，进而抑制肺癌细胞株801D的侵袭能力。另外，姜黄素可经PI3K/AKT/mTOR通路明显抑制TGF-β1诱导的肺癌A549细胞上皮间质转化[13]。在对子宫内膜癌HEC-1-B的研究中，陈茜等[14]发现姜黄素可抑制上游核转录因子NF-κB活性而下调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表达，进而抑制人子宫内膜癌HEC-1-B细胞的侵袭和转移。然而，姜黄素抑制癌细胞转移的机制尚未完全阐明。经典的TGF-β/smad通路及其下游转录因子(ZEB1、TWIST1、SNAIL等)在调控肿瘤细胞EMT和转移中的作用已被广泛认可[15-16]，有研究表明姜黄素可以经抑制TGF-β通路抑制肿瘤细胞转移[6,17-18]，但姜黄素如何调控TGF-β通路尚未明确。SRPK1可磷酸化SRSF1进而调控基因可变剪接[19-20]，并可促进肺癌[7,21]、基底细胞癌[22]等肿瘤细胞的转移。但SRPK1、TGF-β1和肿瘤细胞转移的关系尚未明确。本研究以RNA干扰的方法建立低表达SRPK1的A549细胞系，与正常A549细胞相比，前者TGF-β1及其下游转录因子ZEB1、TWIST1、SNAIL等均显著下调，提示SRPK1可正调控TGF-β1通路。

综上，姜黄素能通过下调SRPK1的表达来抑制肺癌A549细胞的迁移。但本研究未能阐明SRPK1调控TGF-β1的具体机制，且还需要注意的是，尽管TGF-β1可以通过smad途径促进ZEB1、TWIST1、SNAIL等转录因子的表达，但理论上并不能排除SRPK1通过非TGF-β1途径对上述转录因子调控的可能。