KLK13与食管癌患者临床病理特征及预后的关系

李一帆，陈立平，周 瑞，胡燕芳

食管癌是一种较常见的恶性肿瘤，我国发病率较高，生存率较低，患者预后较差[1]。目前电子内镜、超声等诊断技术提高了食管癌的诊断准确率，然而检测费用相对高昂，限制了其在临床的普遍应用。因而寻找诊断食管癌的相关标志物及治疗靶点非常重要。激肽释放酶(KLK)是一组具有多种生理功能的丝氨酸蛋白酶，KLK13是新发现的KLK基因，位于染色体19q13.4上[2]。较早的一项研究表明，KLK13等KLK基因在乳腺癌等恶性肿瘤中表达，并且是乳腺癌预后良好的独立影响因素[3]。另有研究表明，KLK13在早期卵巢癌患者中过表达，且其高表达与不良预后、无复发生存期明显相关[4]。目前KLK13与食管癌临床病理特征的相关研究较少，了解其表达与食管癌临床病理特征、预后的关系，可有效预防食管癌的发生，进而降低发病率、改善患者预后。本研究通过回顾性分析91例食管癌KLK13表达与患者临床病理特征和1年生存率的关系，旨在为食管癌的预防、诊治提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年5月—2019年9月于本院行食管癌切除术的91例食管癌作为患者组，男50例、女41例；年龄(57.04±12.08)岁。纳入标准：符合食管癌诊断标准[5]，且经病理检查确诊；在本院接受手术治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；肿瘤远处转移；有放、化疗手术史；患有严重感染；伴重要脏器器质性病变；临床病理资料不全。另收集30例正常受试者作为正常对照组，男20例、女10例；年龄(55.76±11.42)岁。2组性别、年龄等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 取患者组手术切除的食管癌组织和正常对照组的正常食管组织，检测KLK13表达情况；回顾性分析患者组临床病理资料，包括年龄、临床TNM分期[6]、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移等，分析KLK13表达与食管癌患者临床病理特征的关系。全部食管癌患者通过门诊方式随访1年，术后每月随访1次，随访截止时间为2020年10月或疾病进展，统计分析食管癌患者中位生存期及1年生存率，生存期为入组至末次随访日期或患者死亡时间。进一步采用Cox回归模型分析食管癌患者1年生存率的影响因素。

1.3KLK13表达检测 由本院病理科采用免疫组织化学染色法检测KLK13表达，操作按照说明书进行，鼠抗人KLK13抗体购自上海Sigma-Aldrich有限公司。2组病变组织标本均使用10%甲醛固定、脱水、石蜡包裹，连续切片4 μm，切片后常规染色，再行EnVision两步法免疫组织化学染色。切片脱蜡至水、高压修复后使用3%过氧化氢灭活过氧化物酶，4℃ 24 h，再使用DAB染色。同时使用阳性切片作对照，PBS作阴性对照。结果判定：每张切片由2位病理科医师采用双盲法确认，于光学显微镜下随机选取5个视野观察，每个视野计数200个细胞。细胞质出现黄色为KLK13染色阳性，细胞质阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞10%～25%为+，阳性细胞25%～50%为++，阳性细胞≥50%为+++。

1.4统计学方法 应用SPSS 20.0软件分析数据。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验绘制生存率曲线，采用Cox回归分析模型探讨影响食管癌患者1年生存率的因素。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.12组KLK13表达比较 KLK13在食管癌组织中的阳性表达率低于在正常组织中的阳性表达率(P<0.05)，见表1。

表1 激肽释放酶13在正常组织、食管癌组织中的表达[例(%)]

2.2KLK13表达与食管癌患者临床病理特征的关系 不同TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移情况的食管癌患者癌组织中KLK13的阳性表达情况比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 激肽释放酶13表达与食管癌患者临床病理特征的关系(例)

2.3KLK13表达与食管癌患者1年生存率的关系 KLK13阴性表达患者的1年生存率为60.00%(33/55)，KLK13阳性表达患者的1年生存率和中位生存时间分别为36.11%(13/36)和6.10个月，KLK13阴性表达患者的1年生存率高于阳性表达患者(P<0.05)，见图1。

图1 激肽释放酶13表达与食管癌患者1年生存率的关系

2.4食管癌患者1年生存率的多因素Cox回归分析 利用Cox回归模型对筛选出的4个因素(TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移)行多因素分析。以影响食管癌患者1年生存率为自变量，上述4个因素为因变量，赋值情况：TNM分期(Ⅰ期=0、Ⅱ期=1、Ⅲ期=2)，肿瘤分化程度(高分化=0、中分化=1、低分化=2)，肿瘤大小(<4 cm=0、≥4 cm=1)，淋巴结转移(无=0、有=1)，KLK13表达(阴性=0、阳性=1)。结果表明，肿瘤低分化程度、KLK13阳性表达是食管癌患者1年生存率的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 食管癌患者1年生存率的多因素Cox回归分析

3 讨论

食管癌在我国高发，且多数是鳞癌[7]。虽然食管癌的治疗方式较多，如切除术、放化疗、内镜治疗等，但是生存率一直不高[8]。近几年，肿瘤免疫成为食管癌治疗的新突破口[9]。有研究指出，KLK通过导致细胞外基质的结构改变与基底膜的裂解，从而促使肿瘤血管生成[10]。还有报道发现，KLK13可作用于细胞外基质的蛋白酶，促使肿瘤细胞的侵袭与迁移[11]。Darling等[12]发现KLK13在唾液腺肿瘤中高表达，可作为诊断唾液腺肿瘤较敏感的生物学标志物。而KLK家族在食管癌中的相关报道较少，故本研究通过检测食管癌患者的KLK13表达情况，并分析其临床意义，以期为食管癌肿瘤免疫治疗提供新的思路。

Lin等[13]研究发现，KLK13在食管鳞癌中的表达下降，可能成为食管鳞癌新的治疗靶点。本研究结果表明，食管癌组织中的KLK13阳性表达率低于正常组织中的阳性表达率，提示KLK13在食管癌组织中的表达下调。闫明等[14]研究指出，KLK13的表达与食管癌患者TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移等病理特征存在关联。同样本研究也发现，临床TNM分期越高、分化程度越严重、肿瘤直径越大、伴随淋巴结转移的食管癌患者KLK13阳性表达水平越高，表明KLK13可能参与了食管癌的发生发展。同时，本研究还发现KLK13阴性表达患者的1年生存率高于阳性表达患者，提示KLK13有望成为食管癌预后的评估指标，对于食管癌的临床治疗有特殊意义。上述研究均认为KLK13高表达预示着食管癌患者预后较差，同样Nohara等[15]研究也发现，与KLK13阴性表达食管癌患者相比，阳性表达患者的预后明显较差。在食管癌预后多因素分析中，本研究发现肿瘤低分化程度、KLK13阳性表达是影响食管癌患者1年生存率的独立危险因素，提示低分化、KLK13阳性表达的食管癌患者具有疾病进展高风险，因而临床应重视该类患者并制定有效方案，以期改善患者预后。

综上所述，KLK13在食管癌组织中阳性表达率较低，其参与了食管癌的发生发展过程，且KLK13阳性表达可能提示患者病情较严重、预后较差，有望成为临床诊断、评估预后的标志物，可为食管癌的肿瘤免疫治疗提供全新的思路。