CD47表达升高与子宫内膜癌进展相关

毛邱娴 熊美丽 王文珍 林岱华

子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，每年造成全球约7.6万名女性死亡，发病率呈逐年上升趋势[1]。虽然很多患者可以通过各种影像技术及早发现无症状的子宫内膜癌，或其他技术早期诊断[2]。通过手术治疗结合放化疗可取得较好的预后，但部分患者容易发生复发和转移，很难治愈，死亡率高[3]。因此，探讨识别子宫内膜癌恶化进展风险的可靠生物学标志，不仅可为判断疾病预后、指导个性化治疗提供参考，还可为发展新的治疗靶点和治疗手段提供线索，具有重要的临床意义。

肿瘤进展的重要机制之一是免疫逃逸，逃脱机体的免疫监控后，肿瘤细胞的恶性生物学行为包括增殖、侵袭和转移将会进一步加快[4-5]。CD47是一种新的免疫抑制信号分子，在肿瘤细胞的免疫逃逸机制中发挥重要作用。信号调节蛋白α(Signal regulatory protein α，SIRPα)是CD47的重要配体，健康细胞通过广泛表达CD47，与巨噬细胞上的SIRPα结合，产生“不要吃我”信号，阻止巨噬细胞吞噬健康细胞。然而这一机制被狡猾的肿瘤细胞利用。CD47在多种肿瘤细胞中过度表达，与SIRPα结合启动抑制性信号通路，导致肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用[6-7]。因此，阻断CD47-SIRPα信号的肿瘤免疫治疗具有很好的应用前景。

关于CD47在子宫内膜癌中的表达和作用的研究报道罕见。Gu等[8]曾报道CD47在子宫内膜癌组织中表达升高，阻断CD47不仅可以激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，促进巨噬细胞向肿瘤募集，还可限制肿瘤的生长。但CD47与子宫内膜癌恶性程度和预后的关系尚未见报道，CD47在子宫内膜癌的作用机制仍有待深入挖掘。本研究拟通过综合分析TCGA、GEO和THPA数据库中子宫内膜癌的基因和蛋白表达数据及临床资料，探讨CD47在子宫内膜癌中的表达情况及其与肿瘤进展和预后的关系，为进一步理解CD47在子宫内膜癌中的作用机制提供线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 GEO数据集 以“Endometrial cancer”为关键词，在GEO官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索相关数据集，最终选取同时具有正常子宫内膜组织和肿瘤组织表达数据的三个数据集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)进行差异表达分析。

1.1.2 THPA数据库 以“CD47”为关键词，在THPA官网(https://www.proteinatlas.org/)检索CD47在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌中的蛋白表达数据，并进行整理分析。

1.1.3 TCGA数据集 使用R语言RTCGA包从TCGA官网(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载子宫内膜癌(n=541)的基因表达和临床数据(包括生存资料和肿瘤分级信息)，并提取指定基因的表达值。

1.2 分析流程及方法

分析流程概述如下(图1)：①使用GEO官网自带的GEO2R工具，对GSE63678、GSE36389和GSE115810三个数据集分别进行差异表达分析，并将CD47的表达值和P值提取出来，使用GraphPad Prism 8.0.2软件作箱型图；将THPA官网中CD47在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌中的蛋白表达数据进行提取和分析，使用GraphPad Prism 8.0.2软件作堆积柱形图。②使用R语言RTCGA包将子宫内膜癌相关基因表达值和生存资料提取出来，采用SPPSS 16.0和GraphPad Prism 8.0.2软件进行ROC曲线和生存分析(Kaplan-Meier and Log-rank test)。③将GSE63678、GSE36389和GSE115810三个数据集中差异表达P<0.05的基因提取出来，利用欧易生信工具(https://cloud.oebiotech.cn/task/)作文氏图，得出共同差异表达基因集；利用Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)对294个共同差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，并将CD47相关的GO和KEGG通路挑选出来(结果主要为GO富集通路)，利用欧易生信工具作富集气泡图。㈣使用R语言RTCGA包将子宫内膜癌中CD47相关的GO通路基因表达值提取出来，使用GraphPad Prism 8.0.2进行软件差异表达分析(Mann-Whitney U test)和绘制箱型图；采用SPPSS 16.0和GraphPad Prism 8.0.2软件进行ROC曲线和生存分析(Kaplan-Meier and Log-rank test)。⑤使用R语言RTCGA包将子宫内膜癌的肿瘤分级信息提取出来，并用GraphPad Prism 8.0.2软件分析不同级别肿瘤中基因的表达差异(Mann-Whitney U test)和绘制箱型图。

图1 分析流程图

2 结果

2.1 CD47在子宫内膜癌中表达升高

对GEO三个数据集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)进行差异表达分析发现，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中CD47的基因表达水平显著升高(图2A)。对THPA数据库中CD47在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌中的蛋白表达数据进行分析发现，子宫内膜癌组织CD47阳性染色的比例和强度均高于正常组织(图2B、图2C)。以上结果表明，CD47在子宫内膜中基因和蛋白表达均升高，提示CD47在子宫内膜癌进展中发挥作用。

注：A， CD47在GEO三个数据集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)中的表达；N：正常(Normal)，T：肿瘤(Tumor)；B，THPA数据库中CD47在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌中的免疫组化阳性染色比例；C，CD47在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌中的免疫组化染色代表图。*P<0.05，**P<0.01

2.2 CD47高表达与不良预后相关

TCGA数据集提供基因表达数据和患者生存资料、肿瘤分级等临床信息，可进行生存分析以确定CD47表达和子宫内膜癌预后的关系。ROC曲线分析确定CD47区分生存结局的Cut-off值是22.75(图3A)；将CD47表达>22.75的划分为CD47-High组，<22.75的划分为CD47-Low组，然后进行生存分析，结果发现CD47-High组的总体生存率比CD47-Low组的明显下降(图3B)，表明CD47表达升高与子宫内膜癌不良预后相关。

注：A，ROC曲线分析确定CD47区分生存结局的Cut-off值；B，CD47表达与生存分析。数据来源于TCGA子宫内膜癌数据集

2.3 与CD47相关的GO富集分析

将GSE63678、GSE36389和GSE115810三个数据集中的差异表达基因作文氏图分析，发现294个基因(包含CD47)在三个数据集中均有差异表达(图4A)。分析差异表达基因所在的信号通路，可发现哪些通路的功能改变导致了肿瘤的发生发展。利用Metascape对294个共同差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，并将CD47相关的GO和KEGG通路挑选出来，结果发现与CD47相关的主要为GO生物过程通路，而且前10个富集的GO通路中，3个为调控细胞激活的通路，7个为调控肌动蛋白细胞骨架构建过程的通路(图4B)。肌动蛋白细胞骨架对于维持细胞的形状和结构以及细胞迁移至关重要，表明在子宫内膜癌中，CD47可能参与肌动蛋白细胞骨架的调控，进而调控细胞的增殖和迁移。

注：A，GEO三个数据集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)差异表达基因的文氏图，其中294个基因(包含CD47)在三个数据集中均有差异表达。B，GO富集气泡图。气泡图展示前10个富集的与CD47相关的GO通路(从下往上)

2.4 相关GO通路基因与CD47表达的关系和预后分析

利用TCGA子宫内膜癌数据集，分析相关GO通路基因与CD47表达及疾病预后的关系。结果发现所有相关基因中，调控肌动蛋白细胞骨架构建过程相关的基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47-High组中的表达比CD47-Low组显著增高(图5A)。生存分析发现，FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1的高表达均与不良预后相关(图5B)，进一步提示CD47表达升高与调控肌动蛋白细胞骨架构建过程相关的基因表达升高有一定关系，而它们的表达升高又与子宫内膜癌不良预后相关。

注：A， CD47相关GO通路基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47-Low和CD47-High组的表达情况。B，FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1的表达与预后分析，通过ROC曲线确定区分基因高低表达组的Cut-off值。数据来源于TCGA子宫内膜癌数据集。*P<0.05，***P<0.001

2.5 CD47及相关基因在高级别子宫内膜癌中表达升高

分析CD47及相关GO通路基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在不同级别子宫内膜癌中的表达变化，发现CD47及FAM49B、CLIP2在高级别的子宫内膜癌中表达升高(图6)，表明CD47、FAM49B和CLIP2表达升高与子宫内膜癌的恶化程度有关，提示CD47及其相关的调控肌动蛋白细胞骨架的通路在子宫内膜癌的进展中发挥重要作用。

注：CD47及CD47相关GO通路基因包括包括FAM49B、CLIP2 DIAPH1和F2RL1在不同级别子宫内膜癌中的表达。数据来源于TCGA子宫内膜癌数据集。**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

CD47-SIRPα信号介导肿瘤逃避免疫监视的观点已被广泛接受。CD47在多种肿瘤中过表达，包括非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、平滑肌肉瘤、骨肉瘤和头颈部鳞状细胞癌等[9]。而且，CD47的高表达与多种肿瘤的进展和不良预后有关，包括急性髓样白血病[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12-13]、结直肠癌[14]、食管鳞状细胞癌[15]及口腔鳞状细胞癌[16]等。我们和Gu等[8]研究发现，CD47在子宫内膜癌组织中的表达也显著升高；我们还进一步发现，CD47高表达与子宫内膜癌恶性程度和不良预后相关，提示CD47在子宫内膜癌进展中发挥重要作用。

然而，通过对子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织差异表达基因所在的通路进行富集分析发现，CD47主要参与调控肌动蛋白细胞骨架的构建过程，提示肿瘤组织过度表达CD47，除了免疫逃避的目的之外，还可能让其发挥其他有益于肿瘤细胞生存的作用。Pai 等[16]揭示了CD47在肿瘤中的其他作用，他们发现CD47-SIRPα信号传导可诱导口腔鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化和肿瘤干性，并与患者预后不良相关。肿瘤细胞高表达CD47往往意味着更强的迁移和侵袭能力[17]。研究表明，CD47可调控肺癌细胞中CDC42的表达[18]，而CDC42表达可增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[19-20]。CD47也可通过与其他蛋白相互作用调控肿瘤细胞的增殖和迁移，如CD47通过与糖酵解酶ENO1结合促使其稳定，进而增强结直肠癌细胞中的有氧糖酵解和ERK活性，从而促进结直肠癌细胞的生长和转移[21]；CD47还可与血小板反应蛋白1(TSP1)相互作用，增强ERK1/2和AKT的活化及survivin的表达，促进皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的生长和迁移[22]。此外，CD47对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用受到microRNA的负调控[23-24]。肌动蛋白细胞骨架对于维持细胞的形状和结构以及细胞迁移至关重要，我们的研究提示CD47还可能参与调控肌动蛋白细胞骨架的构建，进而调控肿瘤细胞的增殖和迁移，然而需要进一步的体内外实验证据的支持。目前，Shinohara等[25]已经证实，CD47与E-cadherin共定位在上皮细胞的细胞间黏附位点，通过参与肌动蛋白细胞骨架的重组调节细胞-细胞黏附和细胞迁移。因此，CD47通过调控肌动蛋白细胞骨架的构建来促进肿瘤细胞的增殖和迁移是很有可能的。

参与构建肌动蛋白细胞骨架过程的相关基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47高表达的子宫内膜癌组织中高表达，并与子宫内膜癌不良预后相关，而且FAM49B、CLIP2还在高级别肿瘤中表达增加，提示他们和CD47之间可能存在协同机制，同时在子宫内膜癌进展中发挥重要作用。目前，尚无证据表明CD47与这些基因存在直接联系，而且，这些基因与肿瘤有关的报道也不多见。Chattaragada等[26]报道FAM49B通过调节肿瘤线粒体的氧化还原反应和新陈代谢来抑制胰腺导管腺癌中的癌细胞增殖和侵袭。Zhang等[27]却认为FAM49B的上调是TASP1促进胆囊癌细胞增殖和转移的重要机制。CLIP2参与了放射性碘暴露导致的乳头状甲状腺癌的基本致癌过程，包括细胞凋亡、促有丝分裂原激活的蛋白激酶信号传导和基因组不稳定性[28]，而且，CLIP2的表达水平呈碘暴露剂量依赖性[29]。在恶性结肠癌细胞中，DIAPH1的表达增加，有助于肿瘤细胞稳定微管并促进转移[30]。DIAPH1的高表达与头颈部鳞状细胞癌和喉鳞状细胞癌(LSCC)的整体存活率低有关，DIAPH1在LSCC细胞中被上调，并且可以通过抑制LSCC细胞凋亡维持肿瘤存活[31]。F2RL1基因编码蛋白酶激活受体2(PAR-2)，Kawaguchi等[32]报道PAR-2在ApcMin / +小鼠模型中具有加速肠肿瘤形成的作用。以上研究支持了CLIP2、DIAPH1和F2RL1可发挥促肿瘤的作用，而FAM49B功能可能更复杂，可通过不同作用机制既能发挥抑制肿瘤的作用，也能发挥促肿瘤的作用。我们的研究首次将CD47与FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1联系起来，在子宫内膜癌中，CD47与这些基因是否存在协同作用机制，共同调控肌动蛋白细胞骨架的构建过程，进而调控肿瘤细胞的增殖与迁移，还有待进一步的研究验证。

综上所述，本研究发现CD47在子宫内膜中表达升高并与不良预后有关，还进一步提示CD47可能通过调控肌动蛋白细胞骨架的构建从而促进子宫内膜癌的进展，为进一步研究CD47在子宫内膜癌中作用的分子机制提供了线索和思路。CD47是判断子宫内膜癌预后的潜在生物标志和免疫治疗靶点。