胃癌组织SOX1和β-catenin的表达及其与临床病理特征、远期预后的相关性*

李腊秀，王科，赵家宁，任博，刘月红

（1.西安市第四医院临床检验中心，陕西西安710004；2.重庆市永川区人民医院检验科，重庆412060；3.西安市第四医院输血科，陕西西安710004；4.沣东新城公共卫生管理中心，陕西西安710086）

胃癌是我国常见消化道恶性肿瘤之一，近年来的发病人数不断增加且呈年轻化趋势，但胃癌目前的早期诊断率较低、整体治疗效果欠佳、预后情况较差[1-2]。多种参与癌细胞增殖、迁移、侵袭调控的基因均在胃癌组织中异常表达，但胃癌的具体发病机制仍未完全明确。性别决定区Y 框蛋白1（sex determining region Y-box 1,SOX1）是近年来新发现的具有抑癌作用的基因，在食管癌、宫颈癌、肝癌中被证实呈低表达及过度甲基化[3-5]。已有胃癌相关的细胞实验证实，过表达SOX1 能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭，且这一抑制作用与抑制β-连环蛋白（β-catenin）的表达、拮抗βcatenin 介导的促癌效应[6]。但SOX1 在胃癌中的表达及临床病理意义均未明确。本研究拟探讨胃癌组织中SOX1 和β-catenin 的表达及其与临床病理特征、远期预后的相关性，旨在阐明SOX1 靶向β-catenin在胃癌发生、发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月—2017年3月在西安市第四医院接受胃癌根治术或姑息性切除术的患者64 例。其中，男性38 例，女性26 例；年龄33～69 岁，平均（46.23±7.72）岁。均经术后病理诊断为胃癌，临床病理资料完整，术前均未接受抗肿瘤治疗。收集患者胃癌组织及距离肿瘤边缘>5 cm的癌旁组织。

1.2 实验试剂及仪器

SOX1、β-catenin 的单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，SP 二步法免疫组织化学试剂盒购自上海邦奕生物公司，RIPA 裂解液、BCA 试剂盒购自上海碧云天公司，正置显微镜购自日本Nikon 公司，凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测SOX1和β-catenin 的表达取胃癌组织和癌旁组织，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明浸蜡后进行包埋，得到蜡块备用。将蜡块制成4 μm 厚度的切片，用二步法SP 法免疫组织化学试剂盒进行染色，主要步骤为：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%过氧化氢孵育进行内源性过氧化物酶灭活，抗原微波热修复后一抗（SOX1、β-catenin 一抗的稀释比例为1∶200）孵育4℃过夜，二抗、三抗孵育各1 h，DAB 显色15 min 后苏木精复染，脱水透明后中性树胶封片，显微镜下观察，SOX1 染色部位主要为细胞浆，β-catenin 染色部位主要为细胞核，参照王米娜[7]的研究评价染色强度及阳性细胞百分比。染色强度：无染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；阳性细胞百分比：无阳性细胞为0 分，阳性细胞<25%为1 分，25%～<50%为2 分，50%～<75%为3 分，≥75%为4 分。两项评分相加，0～3 分为阴性、4～7 分为阳性。

1.3.2 Western blotting 检测SOX1、β-catenin 蛋白相对表达量取胃癌组织和癌旁组织，采用RIPA 裂解液裂解组织，提取蛋白，采用BCA 法测定蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的样本加入SDS-PAGE 凝胶中，电泳后电转移至硝酸纤维素膜（NC 膜），用5%脱脂牛奶室温封闭NC 膜2 h 后加入1∶1 000 稀释的SOX1、β-catenin 一抗或1∶5 000 稀释的β-actin一抗（阴性对照），4℃孵育过夜；次日，TBS-T 溶液洗膜后室温孵育1∶1 000 稀释的HRP 二抗1 h，再次洗膜并在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，用Image J 软件分析条带灰度值，根据条带灰度值计算SOX1、β-catenin 蛋白相对表达量。

1.3.3 远期生存的随访随访截止日期为2019年10月31日，通过查询门诊或住院资料、电话回访的方式进行生存情况随访。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析采用Pearson法。绘制Kaplan-Meier 生存曲线，比较采用Log-rank χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁组织SOX1 和β-catenin 阳性表达率及蛋白相对表达量的比较

胃癌组织与癌旁组织SOX1 和β-catenin 阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05），胃癌组织SOX1 阳性表达率低于癌旁组织，胃癌组织β-catenin 阳性表达率高于癌旁组织。胃癌组织与癌旁组织SOX1 和β-catenin 蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05），胃癌组织SOX1 蛋白相对表达量低于癌旁组织，胃癌组织β-catenin 蛋白相对表达量高于癌旁组织（见图1、2 和表1）。胃癌组织SOX1 蛋白相对表达量与β-catenin 蛋白相对表达量呈负相关（r=-0.347，P=0.017）。

图1 胃癌组织及癌旁组织SOX1和β-catenin的表达（免疫组织化学×400）

图2 胃癌组织及癌旁组织SOX1和β-catenin的蛋白表达

表1 胃癌组织及癌旁组织SOX1和β-catenin阳性表达率及蛋白相对表达量的比较

2.2 不同临床病理特征胃癌组织SOX1 和βcatenin阳性表达率的比较

不同肿瘤直径的胃癌组织SOX1 和β-catenin 阳性表达率的比较，差异无统计学意义（P>0.05）。不同分化程度、TNM 分期、淋巴结转移的胃癌组织SOX1阳性表达率的比较，差异有统计学意义（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移胃癌组织SOX1的阳性表达率低于中、高分化，TNM Ⅰ、Ⅱ期，无淋巴结转移胃癌组织。不同分化程度、TNM 分期、淋巴结转移的胃癌组织β-catenin 阳性表达率的比较，差异有统计学意义（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴结转移胃癌组织β-catenin 的阳性表达率高于中、高分化，TNMⅠ、Ⅱ期，无淋巴结转移胃癌组织。见表2。

表2 不同临床病理特征胃癌组织SOX1和β-catenin阳性表达率的比较 例（%）

2.3 SOX1 和β-catenin 阳性表达、阴性表达患者总生存期的比较

SOX1 阴性表达患者与SOX1 阳性表达患者的总生存期比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.079，P=0.043），SOX1 阳性表达患者的总生存期延长；β-catenin 阴性表达患者与β-catenin阳性表达患者的总生存期比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.332，P=0.021），β-catenin 阳性表达患者的总生存期缩短。见图3、4。

图3 SOX1阴性表达与阳性表达患者的生存曲线

图4 β-catenin阴性表达与阳性表达患者的生存曲线

3 讨论

癌细胞过度的增殖、迁移、侵袭是胃癌重要的恶性生物学特征，多因素、多基因参与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭的调控。β-catenin 是经典Wnt 通路中重要的信号蛋白，也是目前已知重要的促癌蛋白，在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤组织中均呈显著高表达的趋势[8-10]。β-catenin 在细胞核中能够启动CyclinD1、c-myc、MMP-2等基因的表达，促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭，进而参与恶性肿瘤的发生、发展。本研究对胃癌组织β-catenin 的分析显示，胃癌组织β-catenin 的阳性表达率高于癌旁组织，且与分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关，说明βcatenin的高表达与胃癌的发生、发展有关。

β-catenin 在恶性肿瘤中表达增多的机制复杂，其中SOX1可能是β-catenin的负性调控分子。研究证实[6]，过表达SOX1 能够通过降低β-catenin 的表达来抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭；另有乳腺癌及鼻咽癌相关的细胞实验也证实SOX1能够抑制β-catenin的表达[11-12]。SOX1 介导的抑癌作用在近些年受到越来越多的关注，多项研究已经证实SOX1表达降低及过度甲基化与食管癌、宫颈癌、肝癌的发病有关[3-5]。本研究在既往关于SOX1研究的基础上探讨胃癌组织SOX1表达的变化：胃癌组织SOX1的阳性表达率较癌旁组织降低，且与分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关，说明SOX1 的低表达与胃癌的发生、发展有关。进一步通过相关性分析发现：胃癌组织SOX1 蛋白相对表达量与β-catenin 蛋白相对表达量呈负相关，结合SOX1 在离体胃癌细胞中对βcatenin 表达的抑制作用[6]推测，胃癌组织中低表达的SOX1 可能增加β-catenin 的表达并促进了胃癌的发生、发展。

目前胃癌患者的整体预后情况较差，手术后的生存率较低，TNM 分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移、幽门螺杆菌感染、原癌基因及抑癌基因表达异常均是影响胃癌患者预后及远期生存的相关因素[13-14]。本研究中，在明确SOX1 低表达及β-catenin低表达与胃癌发生及临床病理特征恶化的关系后，进一步对患者的总生存时间进行随访，并比较SOX1和β-catenin 阳性表达、阴性表达患者总生存时间的差异，结果显示：与SOX1 阴性表达患者比较，SOX1 阳性表达患者的总生存期延长；与β-catenin阴性表达患者比较，β-catenin 阳性表达患者的总生存期缩短。这说明SOX1 低表达及β-catenin 高表达会使胃癌患者的总生存期缩短，与SOX1 低表达及β-catenin 高表达参与胃癌发生、临床病理特征恶化的分析结果一致。

综上所述，胃癌组织SOX1 的低表达与β-catenin的高表达有关，且与临床病理特征、远期预后的恶化相关，未来SOX1可能成为研究胃癌诊疗手段的新靶点。