MDR1、PEDF、LRP在宫颈癌中的表达及意义*

彭钧，鲍方，李小月，王万俊，开蕾，张二春

[1.安徽医科大学附属安庆医院（安庆市立医院）病理科，安徽安庆246003；2.安庆市第一人民医院检验科，安徽安庆246003]

宫颈癌是女性第4 大常见恶性肿瘤，占全球女性癌症死亡人数的7.5%，持续的人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染是宫颈癌发生的主要原因[1]。我国近年宫颈癌的发生率逐年升高，且呈年轻化趋势[2-3]。多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）是一种高度多态性的基因，是人体内主要的药物转运蛋白P-糖蛋白的编码基因。包括顺铂在内的亲脂性抗肿瘤药可以诱导MDR1 的表达。 色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）是一种内源性糖蛋白，具有促进肿瘤细胞凋亡、分化、抑制增殖和血管生成的作用。肺耐药蛋白（lung resistance-related protein,LRP）是与MDR1 呈正相关的药物外排转运蛋白，在药物抵抗中有重要作用[4]。本研究采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学法检测MDR1、PEDF 和LRP 在宫颈癌组织和正常宫颈组织的表达，探讨其表达水平与宫颈癌临床特征和预后的关系，为宫颈癌的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月—2015年12月在安徽医科大学附属安庆医院就诊的宫颈癌患者58 例（宫颈癌组）及子宫良性病变行子宫切除术患者9 例（对照组）。宫颈癌组年龄24～73岁，平均（63.46±4.73）岁；平均体重指数为（22.39±3.06）kg/m2；病理类型均为鳞癌；FIGO 分期标准：Ⅰ期20 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期16例。对照组年龄22～66岁，平均（53.46±4.33）岁；平均体重指数为（21.79±3.24）kg/m2。纳入标准：经病理证实为宫颈鳞状细胞癌；未经化疗、放疗及免疫治疗；取得患者知情同意并经医院伦理委员会批准。排除标准：既往有宫颈病变史及免疫缺陷者。

1.2 RT-PCR 检测MDR1、PEDF、LRP mRNA 相对表达量

取宫颈癌组患者癌组织和对照组的正常宫颈组织检测MDR1、PEDF、LRP mRNA 相对表达量。采集组织标本后立即将其置于含营养液的无菌瓶中，送实验室处理。用Hank's 液（上海信裕生物科技有限公司）清洗上述组织标本，肿瘤组织标本需切除坏死组织及周围正常组织，剪碎至约1 mm×1 mm小块，加胶原酶37℃消化，制成单细胞悬液。随后Trizol 法提取组织总RNA，逆转录成cDNA。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，循环40 次。MDR1、PEDF、LRP 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列见表1。内参基因选择GAPDH。以cDNA 为模板用上述引物进行RT-PCR，PCR 相关试剂购自于宝生物工程（大连）有限公司。自动生成循环阈值（Ct），2-ΔΔCt法计算MDR1、PEDF、LRP mRNA 相对表达量。RT-PCR结果判定在内参扩增条带一致的基础上，在目的条带位置出现条带者为阳性表达，未出现条带者为阴性表达。根据条带亮度测量光密度值，目的条带光密度值/内参光密度值得到相对系数。

表1 引物序列

1.3 免疫组织化学法检测MDR1、PEDF和LRP蛋白阳性表达

MDR1 兔单克隆抗体（ab170904）、PEDF 兔多克隆抗体（ab233120）和LRP 兔单克隆抗体（ab175239）购自艾博抗（上海）贸易有限公司，免疫组织化学染色试剂盒及DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用Envision 两步法检测MDR1、PEDF 和LRP 蛋白的阳性表达。选取宫颈癌组织石蜡标本切片，厚度为4 μm，烤片后脱蜡和过梯度酒精水洗，进行抗原修复，并用3% H2O2室温孵育20 min 以阻断内源性过氧化物，PBS 清洗后滴加一抗4℃孵育过夜，同时设置阴性对照及阳性对照。第2 天洗去一抗并滴加二抗孵育30 min。DAB显色，苏木精复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明后立即中性树胶封片。免疫组织化学染色由两位病理科医生在400 倍镜下独立进行统计，以棕黄色染色为阳性。着色强度评分：未着色0 分，淡黄色1 分，黄色2 分，黄棕色或黄褐色3 分。阳性细胞百分比评分：染色细胞占视野细胞的1%～25%为1 分，>25%～50%为2 分，>50%～75%为3 分，>75%为4 分。最终评分=阳性细胞百分比得分+着色强度评分，<6 分为弱阳性即低表达，≥6 分为强阳性即高表达。

1.4 统计学方法

数据处理采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较做χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较采用Log-rank χ2检验；绘制ROC曲线。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MDR1、PEDF和LRP mRNA相对表达量比较

两组MDR1、PEDF 和LRP mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），宫颈癌组MDR1、LRP mRNA 相对表达量高于对照组，PEDF mRNA相对表达量低于对照组。见表1。

表1 两组MDR1、PEDF和LRP mRNA相对表达量比较（±s）

表1 两组MDR1、PEDF和LRP mRNA相对表达量比较（±s）

组别n MDR1 mRNA PEDF mRNA LRP mRNA宫颈癌组对照组t 值P 值58 9 0.87±0.14 0.39±0.10 9.872 0.000 0.23±0.07 0.79±0.11 20.549 0.000 0.75±0.12 0.22±0.13 12.198 0.000

2.2 两组MDR1、PEDF 和LRP 蛋白阳性表达率比较

两组MDR1、PEDF 和LRP 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05），宫颈癌组MDR1和LRP 的蛋白阳性表达率高于对照组，PEDF 的蛋白阳性表达率低于对照组。见表2。

表2 两组MDR1、PEDF和LRP蛋白阳性表达率的比较

2.3 宫颈癌组不同临床病理特征患者的MDR1、PEDF和LRP蛋白阳性表达率比较

58 例宫颈癌组患者中，不同FIGO 分期和有无淋巴结转移患者的MDR1、PEDF 及LRP 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；不同年龄的MDR1、PEDF 及LRP 蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 宫颈癌组不同临床病理特征患者MDR1、PEDF和LRP蛋白阳性表达率的比较 例（%）

2.4 MDR1、PEDF 和LRP 高表达和低表达患者中位生存期和5年生存率比较

宫颈癌组患者均门诊或电话随访，其中4 例患者失访，共54 例患者完成随访。根据MDR1、PEDF和LRP 蛋白表达的高低，分为MDR1、PEDF、LRP 高表达组和低表达组。MDR1 高表达组中位生存期为46 个月，MDR1 低表达组中位生存期为51 个月；MDR1 高表达组和低表达组5年生存率分别为31.5%（17/54）和61.1%（33/54），两组5年生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.781，P=0.001），MDR1 高表达组5年生存率低于MDR1 低表达组（见图1）。PEDF 高表达组中位生存期为53 个月，PEDF 低表达组中位生存期为46 个月；PEDF 高表达组和低表达组5年生存率分别为79.6%（43/54）和40.7%（22/54），两组5年生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.354，P=0.000），PEDF 低表达组5年生存率低于PEDF 高表达组（见图2）。LRP 高表达组中位生存期为50 个月，LRP 低表达组中位生存期为52 个月；LRP 高表达组和低表达组5年生存率分别为40.7%（22/54）和75.9%（41/54），两组5年生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.154，P=0.002），LRP 高表达组5年生存率低于LRP 低表达组（见图3）。

图1 宫颈癌组MDR1高表达和低表达患者的生存曲线

图2 宫颈癌组PEDF高表达和低表达患者的生存曲线

图3 宫颈癌组LRP高表达和低表达患者的生存曲线

2.5 MDR1、PEDF和LRP表达对宫颈癌的诊断价值

MDR1 蛋白表达诊断的ROC 曲线下面积为0.884（95% CI：0.819，0.950），敏感性为78.3%（95%CI：0.702，0.864），特异性为81.2%（95% CI：0.753，0.871），具有一定的诊断价值（见图4）。PEDF 蛋白表达诊断的ROC 曲线下面积为0.734（95% CI：0.696，0.773），敏感性为71.3%（95% CI：0.667，0.759），特异性为74.2%（95% CI：0.698，0.786），具有一定的诊断价值（见图5）。LRP 蛋白表达诊断的ROC 曲线下面积为0.716（95% CI：0.684，0.749），敏感性为70.4%（95% CI：0.654，0.754），特异性为71.5%（95% CI：0.653，0.777），具有一定的诊断价值（见图6）。

图4 MDR1表达对宫颈癌诊断价值的ROC曲线

图5 PEDF表达对宫颈癌诊断价值的ROC曲线

图6 LRP表达对宫颈癌诊断价值的ROC曲线

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居女性肿瘤第4 位[5]。宫颈癌早期主要通过子宫根治术治疗，放化疗是局部晚期的宫颈癌患者的标准治疗方法，然而部分宫颈癌患者对化疗有耐药性，预后差[6-8]。化疗耐药被广泛认为是限制治疗效果和影响患者预后的因素之一[9]。美国癌症协会统计，每年死于癌症的患者中，33%与获得性耐药有关[10]。因此，逆转或抑制肿瘤治疗过程中的多药耐药效应具有重要意义。然而对宫颈癌耐药的机制尚未完全清楚，阐明宫颈癌耐药的机制是宫颈癌治疗亟待解决的问题。

研究表明，MDR1 在多个耐药细胞系和宫颈癌细胞中过表达[11]。MDR1 在HeLa 细胞中的表达升高，导致细胞内药物排泄增加，细胞内药物浓度降低，导致HeLa 细胞产生耐药性。在胰腺癌中也有报道，MDR 蛋白表达增加与化疗耐药有关[12]。其变异与蛋白功能、抗癌药动力学改变及患者预后相关[13]。NF-κB、c-fos 和c-jun 已被证明与MDR1 基因的转录激活有关[11]。有研究表明，MDR1 通过与其他蛋白的相互作用，参与调控细胞的侵袭和迁移，从而激活ERK1/2 和P38 MAPK 信号通路，诱导基质金属蛋白酶等肿瘤细胞侵袭相关蛋白的产生[14]。本研究结果显示，宫颈癌组织中MDR1 蛋白阳性表达率高于正常宫颈组织，且与FIGO 分期有关，其中FIGOⅢ期蛋白阳性表达率最高，其次为FIGOⅡ期，FIGOⅠ期最低。MDR1 蛋白阳性表达率也与淋巴结转移有关，在有淋巴结转移的宫颈癌组织中蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移的宫颈癌组织。MDR1 蛋白阳性表达率与年龄无关。MDR1 高表达宫颈癌患者5年生存率低于MDR1 低表达宫颈癌患者。

PEDF 作为一个抑癌基因常在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌中被报道，但在宫颈癌中很少被研究[15]。PEDF 作为一种有前景的治疗靶点，已经在黑色素瘤、肝细胞癌、结肠癌等多种肿瘤中取得较好的治疗效果[16-18]。叶酸受体α（FRα）靶向的纳米脂质体作为载体包裹PEDF基因，经腹腔注射治疗宫颈癌腹膜转移也取得了令人满意的抗肿瘤效果[15]。本研究结果显示，宫颈癌组织中PEDF 蛋白阳性表达率低于正常宫颈组织，且与FIGO 分期有关，其中FIGOⅠ期蛋白阳性表达率最高，其次为FIGOⅡ期，FIGOⅢ期最低。PEDF 蛋白阳性表达率也与淋巴结转移有关，有淋巴结转移的宫颈癌组织中蛋白阳性表达率低于无淋巴结转移的宫颈癌组织。PEDF 蛋白阳性表达率与年龄无关。PEDF 高表达宫颈癌患者5年生存率高于PEDF低表达宫颈癌患者。

LRP 在核质转运、细胞凋亡、DNA 损伤修复、细胞解毒和化疗耐药方面发挥重要作用[19]。LRP 在多发性骨髓瘤、急性白血病等肿瘤中的异常表达可能导致治疗效果较差[20]。Akt/ERK-FOXO1-Nanog 信号通路可调节LRP 蛋白表达，促进凋亡，提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性[20]。肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体可以通过减少MDR1 和LRP 的表达，诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖从而逆转胃癌细胞的耐药性[21]。本研究结果显示，宫颈癌组织中LRP 蛋白阳性表达率高于正常宫颈组织，且与FIGO 分期有关，其中FIGOⅢ期蛋白阳性表达率最高，其次为FIGOⅡ期，FIGOⅠ期最低。LRP 蛋白阳性表达率也与淋巴结转移有关，有淋巴结转移的宫颈癌组织中蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移的宫颈癌组织。LRP 蛋白阳性表达率与年龄无关。LRP 高表达宫颈癌患者5年生存率低于LRP 低表达宫颈癌患者。

综上所述，MDR1、PEDF 和LRP 的表达与宫颈癌的发生、发展密切相关，可作为宫颈癌患者临床特征与预后的参考指标。研究MDR1、PEDF 和LRP 对宫颈癌的诊断和治疗具有重要的指导意义。