番泻苷A对博来霉素诱导的肺纤维化和免疫紊乱的保护作用

王常清，张万涛，唐凤，杨江帆，覃鸿恩，周辉

（恩施土家族苗族自治州中心医院1.中药房；2.西药房；3.制剂室，湖北恩施 445000；4.湖北民族大学附属民大医院西药房，湖北恩施 445000）

肺纤维化是急性、慢性肺部疾病的最终结果，通常与遗传性免疫功能障碍、化学毒性、感染、环境污染等因素有关[1]。肺纤维化主要的临床表现为限制性通气功能障碍、进行性呼吸困难、刺激性干咳、弥散功能降低等，双肺弥漫性病变是其典型的影像学特征，患者确诊后病情进展快，死亡率较高，但目前仍缺乏确切有效的治疗手段[2‑3]。尽管肺纤维化的发病机制尚不明确，但目前普遍认为是炎症反应、氧化应激和细胞外基质代谢失衡等多种机制相互作用的结果[4‑5]。番泻叶是一种药用价值较高的中药药材，主要用于改善便秘、解决大便干燥，主要活性成分包括番泻苷A（sennoside A，SA）、番泻苷B、大黄酚、大黄素、大黄酸等[6]。研究表明，大黄素[7]、大黄酸[8]可通过不同作用途径保护肺部炎性损伤。但来自相同母体SA在肺部疾病的相关研究较少，本课题前期预实验初步发现，SA对肺纤维化大鼠具有保护作用。因此，本研究主要将探讨SA对博来霉素（bleomycin，BLM）诱导肺纤维化大鼠的保护作用及其机制，旨在为肺纤维化的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只SD大鼠，SPF级，雄性，6~8周龄，体质量200~240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2019‑0115。

1.2 药品、试剂与主要仪器

SA（成都瑞芬思生物科技有限公司）；BLM（浙江海正药业股份有限公司）；MASSON试剂（南京建成科技有限公司，批号：20180025）；纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子β（TGF‑β）、α‑平滑肌蛋白（α‑SMA）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及白细胞介素10（IL‑10）蛋白一抗（美国CST，批号：9532、1165、2358、4175、8630）；白细胞介素（IL‑1β、IL‑4、IL‑10）及iNOSELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：20180120、20181054、20190108、20190337）；AniRes2005型小动物肺功能仪（北京贝兰博科技有限公司）；iMARK系列酶标仪、CFX96荧光定量PCR仪（美国BioRad）。

1.3 大鼠肺纤维化模型的建立与给药

将50只大鼠随机分为正常组、模型组、模型+SA低、中、高剂量处理组，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，除正常组外，其他组大鼠一次性气管滴注5 mg/kg BLM构建肺纤维化模型，再轻轻摇摆大鼠30 s，使药液在肺内均匀分布，正常组大鼠滴注等体积生理盐水。建模后第1天，模型+SA低、中、高剂量处理组分别灌胃25、50、100 mg/kg SA[9]，1次/d，连续灌胃28 d，正常组和模型组以等体积生理盐水。

1.4 观察指标

1.4.1 肺功能检测 给药结束后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，于气管正中切口，插入气管插管，连接小动物肺功能仪，检测静息通气量、气道阻力及肺容积。

1.4.2 样本采集 麻醉大鼠收集腹主动脉血，3000r/min离心20 min，分离上层血清，冻存于−80℃冰箱。迅速取出肺组织，分别称量肺组织湿质量和干质量，计算干湿重比值，部分固定于4%（φ）多聚甲醛中，剩余肺组织冻存于液氮罐。

1.4.3 肺组织形态学观察 肺组织固定24 h后，制成4μm厚的石蜡切片，分别进行HE、MASSON染色，光镜下观察肺组织病理变化和纤维化程度，参照Szapiel等[10]方法，对HE染色结果进行肺损伤评分。

1.4.4 ELISA检测 取血清样本，按ELISA试剂盒说明，检测血清中IL‑1β、IL‑4、IL‑10及iNOS的含量。

1.4.5 RT‑PCR检测 取适量冻存肺组织，添加Trizol试剂提取肺组织中总RNA，经微量核酸仪检测提取物纯度、浓度，再通过2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整度；逆转录合成cDNA链，按试剂盒说明进行RT‑PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共40个循环。FN上游引物序列：5’‑TGACAACTGCCCGTAGACCT‑GG‑3’，下游引物序列：5’‑TACTGGTTGTAGGTGT‑GGCCG‑3’；TGF‑β上游引物序列：5’‑GTCAAA GGGCATCTAAAGC‑3’，下游引物序列：5’‑CAA AGAACTCCTGGATAAACT‑3’；α‑SMA上游引物序列：5’‑TCCTGACCCTGAAGTATCCG‑3’，下游引物序列：5’‑TCTCCAGAGTCCAGCA‑CAAT‑3’；GADPH上游引物序列：5’‑GGCACAGT‑CAA GGCTGAGAATG‑3’，下游引物序列：5’‑ATG‑GTGGTGAAGACGCCAGTA‑3’。以GADPH为内参，计算FN、TGF‑β及α‑SMA mRNA的相对表达量。

1.4.6 Western blot检测 取适量冻存肺组织，添加裂解缓冲液提取肺组织中蛋白，混合5×上样缓冲液中，经沸水浴变性10 min，配制10%（φ）聚丙烯酰胺‑SDS凝胶，取等量变性蛋白进行电泳，再通过湿转法转移至PVDF膜上，置于含有5%脱脂奶粉的封闭液中孵育2 h，稀释比1∶1 000的蛋白一抗中，4℃下孵育过夜，稀释比1∶8 000的蛋白二抗中，室温孵育1 h，最后化学发光显影。应用Image J软件检测各条带灰度值，目的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值表示该目的蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

实验数据以±s表示，采用软件SPSS17.0进行统计学分析，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SA对肺纤维化大鼠肺损伤评分和肺组织干湿质量比的影响

如图1，与正常组比较，模型组肺损伤评分和肺组织干湿质量比明显增加（P<0.05）；与模型组比较，SA中、高剂量处理组肺损伤评分和肺组织干湿质量比明显降低（P<0.05）；但SA低剂量处理组与模型组上述指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 SA对肺纤维化大鼠肺损伤评分和肺组织干湿比的影响Figure 1 Effect of SA on lung injury score and lung dry/wet ratio in rats with pulmonary fibrosis

2.2 SA对肺纤维化大鼠肺功能指标的影响

如图2，与正常组比较，模型组大鼠静息通气量、气道阻力及肺容积明显降低（P<0.05）；与模型组比较，SA中、高剂量处理组静息通气量、气道阻力及肺容积明显升高（P<0.05）；但SA低剂量处理组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 SA对肺纤维化大鼠肺功能指标的影响Figure 2 Effect of SA on pulmonary function indexes in rats with pulmonary fibrosis

2.3 SA对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学的影响

如图3，正常组大鼠肺组织结构正常，无明显炎性细胞浸润；模型组大鼠肺组织细胞结构严重破坏，肺泡间隔明显增厚，炎性细胞浸润显著；SA低、中、高剂量处理组肺组织中仍有肺泡损害、间隔增厚和炎性细胞浸润现象，其中中、高剂量组肺组织损伤程度较模型组轻。

图3 SA对肺纤维化大鼠肺组织病理损伤的影响(HE，200×)Figure 3 Effect of SA on pathological injury of lung tissue in rats with pulmonary fibrosis(HE,200×)

2.4 SA对肺纤维化大鼠肺组织纤维化程度的影响

如图4，正常组肺泡结构正常，蓝色染色区域极少；模型组肺泡结构破坏，肺泡融合，蓝色染色区域面积较正常组明显增加；SA低、中、高剂量处理组肺泡结构也表现出不同程度的损伤，其中中、高剂量组蓝色染色区域面积较模型组明显减少。

图4 SA对肺纤维化大鼠肺组织纤维化程度的影响（MASSON，200×）Figure 4 Effect of SA on the degree of pulmonary fibrosis in rats with pulmonary fibrosis(MASSON,200×)

2.5 SA对肺纤维化大鼠免疫相关标记物表达的影响

如图5，与正常组比较，模型组大鼠血清IL‑1β、iNOS、IL‑4、IL‑10含量、肺组织中iNOS及IL‑10表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，SA中、高剂量处理组血清IL‑1β、iNOS含量、肺组织中iNOS表达明显降低，血清IL‑4、IL‑10含量、肺组织中IL‑10表达明显升高（P<0.05）；但SA低剂量处理组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图5 SA对肺纤维化大鼠免疫相关标记物表达的影响Figure 5 Effect of SA on the expression of immune related markers in rats with pulmonary fibrosis

2.6 SA对肺纤维化大鼠肺组织中纤维化标记物表达的影响

如图6，与正常组比较，模型组大鼠肺组织中FN、TGF-β、α‑SMA mRNA及蛋白的表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，SA中、高剂量处理组FN、TGF-β、α‑SMA mRNA及蛋白的表达明显降低（P<0.05）；但SA低剂量处理组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图6 SA对肺纤维化大鼠肺组织中纤维化标记物表达的影响Figure 6 Effect of SA on the expression of fibrosis markers in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis

3 讨论

肺纤维化主要包括3个阶段，肺内炎症阶段（免疫反应阶段）、肺实质损伤阶段及肺泡腔纤维化/肺泡塌陷阶段，其中肺泡上皮细胞受损、肺泡炎症、胶原沉积等是其主要发病因素[11]。肺纤维化早期病理表现为弥漫性肺泡炎症，多种炎性细胞及细胞因子刺激成纤维细胞过度增殖，转化成肌成纤维细胞，导致细胞外基质代谢紊乱，一部分细胞外基质成分过度沉积于肺间质和肺泡，加之纤维组织异常修复，破坏肺组织固有的正常结构，最终致使肺纤维化的发生[12]。肺组织干湿比是反映肺实变的直观指标之一，细胞水肿、炎性物质伸出及毛细血管充血等因素是干湿比升高的直接原因[13]。本研究结果显示，SA可有效减轻肺纤维化大鼠肺损伤评分和肺组织干湿质量比，提示SA对肺纤维化大鼠肺组织具有保护作用。

BLM是一类多肽类抗肿瘤药物，其诱导的肺纤维化大鼠模型，主要病理特征为肺组织内慢性炎症和纤维化，这与人肺纤维化表现近似[14]。肺组织病理形态观察显示，模型组大鼠肺组织细胞结构严重破坏，肺泡间隔明显增厚，炎性细胞浸润显著，间质内有大量胶原纤维增生，但中、高剂量SA处理后肺组织结构破坏明显减轻，肺组织胶原沉积也明显减少，提示SA可减轻BLM诱导的肺纤维化。静息通气量、气道阻力及肺容积等肺功能指标常用于判断气流受限，这对于肺纤维化的诊断、病情进展、治疗及预后均有指导性意义[15]。本研究结果显示，与模型组比较，SA中、高剂量处理组静息通气量、气道阻力及肺容积明显升高，提示SA对肺纤维化大鼠肺功能有明显的改善作用。

肺组织损伤后产生的肺泡内炎症，会使机体产生免疫反应，最终导致肺内发生具有不可逆性的纤维化[16]。FN是细胞外基质的主要成分，α‑SMA是活化的成纤维细胞的典型标志物，α‑SMA阳性的肌成纤维细胞是主要的基质合成细胞，而TGF‑β则是重要的致纤维化因子，可活化成纤维细胞，刺激细胞外基质的合成，并诱导多种促纤维化细胞因子的分泌[17]。本研究中，BLM诱导后大鼠肺组织中FN、α‑SMA、TGF‑β的表达上调，SA处理后FN、α‑SMA、TGF‑β的表达下调，提示SA可能通过抑制FN、α‑SMA、TGF‑β的表达，抑制细胞外基质过度沉积，发挥抗纤维化作用。另外，ELISA和Western blot检测结果显示，肺纤维化大鼠促炎细胞介质IL‑1β、iNOS和抑炎细胞介质IL‑4、IL‑10均升高，表明肺纤维化大鼠体内炎症免疫反应处于较高水平，SA处理后IL‑1β、iNOS水平降低，IL‑4、IL‑10水平大幅升高，提示SA可有效减轻肺纤维化大鼠的炎症反应，调节免疫紊乱。

综上所述，本研究发现SA可减轻BLM诱导的肺纤维化，改善肺纤维化大鼠肺功能，其作用机制可能与调节免疫紊乱、抑制细胞外基质过度沉积有关。