黄芪多糖抑制NMDAR/TRPC6通路保护人足细胞的研究

柏琳，于海涛，张金玲，施海涛，孙贵才

(1.齐齐哈尔医学院附属第五医院 大庆龙南医院，黑龙江 大庆 163453； 2.南昌大学附属第一医院，江西 南昌 330006)

慢性肾脏病(CKD)是一个全球性问题，每年会导致数百万人死亡，而且据估计，每年约有32万的CKD患者会发展成终末期肾病(ESRD)。根据全球疾病负担的研究报告，CKD是人类的三大疾病类死亡因素之一。研究表明，CKD与高血压糖尿病肥胖和原发性肾脏疾病加速的年龄相关肾功能下降有关。足细胞是覆盖肾小球基底膜外层的高度特异性上皮细胞，在许多人类肾脏疾病中受损。因此，足细胞是导致肾小球硬化蛋白性肾病的关键靶点。N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDA受体)是受体门的非选择性阳离子通道，在肾脏的各种病理过程中也起着至关重要的作用。瞬时受体电位离子通道蛋白6(TRPC6)是TRPC通道家族的成员。TRPC6突变及其表达和活性上调，与蛋白尿和足细胞丢失等导致CKD的原因有关。鉴于足细胞在CKD发展中的重要地位，有关NMDA受体与足细胞，及TRPC6与足细胞的调控关系已经成为CKD病理的研究热点。

黄芪多糖是黄芪的主要有效成分之一，具有提高免疫力、抗氧化和抗应激等多种功效。大量研究表明，黄芪多糖可以用来治疗慢性肾病，对糖尿病小鼠模型肾脏的超微结构具有保护作用[1-2]。有研究表明，高糖可以通过AngⅡ/TRPC6途径介导足细胞的凋亡[3]。本论文在前期研究中发现，Ang Ⅱ对足细胞的损伤可能是通过NMDA受体-ROS-TRPC6途径来实现的。因此，本文以Ang Ⅱ诱导损伤的人足细胞为研究对象，基于NMDA受体-ROS-TRPC6途径研究黄芪多糖对慢性肾病的治疗机制，以期为黄芪多糖在CKD中的治疗提供科学参考和新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞

人肾足细胞(BNCC340460)购自北京北纳生物公司。

1.2 主要试剂

黄芪多糖标准品(89250-26-0)购自北京索莱宝科技有限公司;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)(35115-60-7)购自美国Sigma公司;蛋白提取试剂盒(635626)、核酸提取试剂盒购(9109)、反转录试剂盒(RR390A)和荧光定量PCR试剂盒(RR430A)购自大连宝生物公司;MTT法检测试剂盒(ab211091)购自美国Abcam公司;人Calcineurin蛋白ELISA检测试剂盒(FU/R2080)和Nephrin蛋白ELISA检测试剂盒购自北京方程科技有限公司(FU-R2937)。

1.3 主要仪器

紫外可见分光光度计、倒置显微镜、荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)和酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.4 实验设计和分组

足细胞分化足细胞培养液的培养瓶中，以37 ℃，CO2浓度5%的条件下培养成熟后，在生长对数期按如下方式对足细胞进行分组：(1)对照组按1∶ 1 000的比例在培养基中加入PRMI1640-培养液；(2)模型组按照1∶ 1 000比例在培养基中加入AngⅡ溶液；(3)给药组按照1∶ 1 000比例在培养基加入AngⅡ溶液，同时在细胞培养液中加入黄芪多糖溶液，使其终浓度为100 μmol/mL，实验期为24 h。

1.5 检测指标和方法

(1)细胞活力检测。实验采用MTT法，具体步骤如下：分别取各组细胞，小心将原培养液吸走；用PBS缓冲液轻轻洗涤3次，然后加入等体积的新细胞培养液；每个孔分别加入MTT溶液10 μL，继续在37 ℃，CO2浓度5%的条件下对足细胞进行培养4 h；小心将每个孔中的细胞培养液吸走，终止培养；每孔分别加入DMSO溶液300 μL，在万向摇床上低速震荡10 min；用酶标仪在检测波长为490 nm的条件下，对空白孔和各样品孔进行检测。

(2)细胞内Ca2+含量的检测。实验采用荧光探针法，具体步骤如下：把Ca2+荧光检测探针按比例稀释；分别取各组细胞，将稀释后溶液分别加入到待测孔中，在37 ℃，CO2浓度5%的条件下对足细胞进行培养20 min；按照5倍体积的比例向待测孔中加入FBS，在37 ℃，CO2浓度5%的条件下对足细胞继续培养40 min；小心吸走上层细胞培养液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；每个孔中加入胰蛋白酶溶液和HBSS溶液，将样品制备成细胞悬液；用荧光检测仪在激发光488 nm，发生光525 nm条件下，对空白孔和各样品孔进行检测，然后收集各孔细胞，测定其总蛋白含量，并用总蛋白对细胞内Ca2+进行校正。

(3)细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测。实验采用荧光探针法，具体步骤如下：按比例对活性氧探针进行稀释；分别取各组细胞，将活性氧探针的溶液200 μL加入到待测孔中；在37 ℃，CO2浓度5%的条件下对足细胞继续培养60 min；小心弃去上层培养液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次；用荧光倒置显微镜对ROS进行观察，并用荧光检测仪在激发光488 nm，发生光525 nm的条件下，对空白孔和各样品孔进行检测，然后收集各孔细胞，测定其总蛋白含量，并用总蛋白对ROS进行校正。

(4)Calcineurin和Nephrin蛋白检测。取各组细胞，将原培养液倒掉；按蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白，ELISA的检测按试剂盒说明进行。

(5)基因的表达进行检测。取各组细胞，将原有的培养液倒掉；按核酸提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书操作对总RNA进行反转录，对cDNA分装后保持于-80 ℃冰箱待用。根据NCBI数据库提供的序列设计各基因引物，GAPDH为内参，具体引物信息如下：

表1 引物信息

根据荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，对各待测基因进行扩增，并采用双标准曲线法，对数据进行相对定量分析。

1.6 数据分析

2 实验结果

2.1 黄芪多糖对足细胞活力、细胞内Ca2+、ROS含量的影响

黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞的影响见表2。从表中可以看出，与对照组相比，AngⅡ刺激显著降低了足细胞的活力(P<0.05)，而在AngⅡ刺激的同时给予黄芪多糖，足细胞活力虽然与对照组相比具有下降趋势力(P>0.05)，但显著高于模型组(P<0.05)。

黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内Ca2+的含量的变化见表2。从表中可以看出，与对照组相比，AngⅡ刺激后足细胞内Ca2+的含量显著高于对照组(P<0.05)，黄芪多糖能显著降低AngⅡ引起的足细胞内Ca2+含量的升高(P<0.05)，但依然显著高于对照组(P<0.05)。

黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内ROS的影响见表2和图1。从表中可以看出，与对照组相比，AngⅡ刺激后足细胞内ROS的含量增加(P<0.05)，在AngⅡ刺激的同时给予黄芪多糖，足细胞内ROS的含量低于模型组(P<0.05)，但依然高于对照组(P<0.05)。

表2 黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞活力、 细胞内Ca2+、ROS含量的影响

图1 黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内ROS的影响

2.4 黄芪多糖对足细胞内Calcineurin和Nephrin的影响

黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内Calcineurin和Nephrin的影响见表3。从图中可以看出，与对照组相比，AngⅡ刺激后足细胞内Calcineurin的含量显著增加(P<0.05)，Nephrin的含量显著下降(P<0.05)；与模型组相比，AngⅡ刺激的同时给予黄芪多糖，可以显著降低足细胞内Calcineurin的含量(P<0.05)，上调Nephrin的含量(P<0.05)，其中Calcineurin的含量显著高于对照组(P<0.05)。

表3 黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内Calcineurin和 Nephrin的影响

2.5 黄芪多糖对足细胞内基因表达的影响

黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内基因表达的影响见表4。从表中可以看出，AngⅡ刺激后足细胞中的NR1和PI3K基因的表达显著高于对照组(P<0.05)，TRPC6、Caspase-3的基因表达则显著低于对照组(P<0.05)；同时给予黄芪多糖后，与模型组相比，足细胞中NR1的基因表达有增加趋势(P>0.05)，且显著高于对照组(P<0.05)，PI3K基因表达则显著提高(P<0.05)，TRPC6、Caspase-3的基因表达显著降低(P<0.05)，其中TRPC6基因的表达显著高于对照组(P<0.05)。

表4 黄芪多糖对AngⅡ刺激后足细胞内 基因表达的影响

3 讨论

目前，人们普遍认为足细胞损伤不仅与蛋白尿的程度有关，而且与肾小球硬化症的发展和肾功能的下降有关[4]。足细胞损伤是许多人类肾脏疾病的早期事件之一，包括微小改变病(MCD)、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、糖尿病肾病(DKD)、膜性肾病(MN)，狼疮性肾炎(LN)和其它CKD[5]。如果能在CKD早期对足细胞进行靶向治疗，通常认为可逆转CKD的发展，至少治疗方法要抑制肾脏中足细胞的丢失。

黄芪是我国传统医学中被广泛应用的一种补益类药材，其入药始见于《神农本草经》。黄芪具有升阳补气、固表止汗、生津养血、托毒排脓等多种功效，在《圣济总录》中就有“补肾黄芪汤”的记载。黄岩龙等使用黄芪桂枝五物汤配合西医方法，对慢性肾病患者进行治疗，取得了良好的效果[6]。黄海健等用黄芪益母汤治疗慢性肾病可以显著降低患者蛋白尿的排泄量[7]。现代医学认为，黄芪具有抗氧化、抑制炎性因子、抗菌等多种生物学活性[8]。黄芪的主要有效成分包括黄芪皂苷、黄芪多糖和黄芪黄酮等，其中黄芪多糖是由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成的复合物质，具有抗氧化、抗应激和调节机体免疫等生物学功能[9]。研究表明，黄芪多糖对缺血再灌注造成的大鼠肾损伤有保护作用[10]。

AngⅡ是造成肾脏发生局部损伤的效应因子之一，可以介导足细胞的损伤[11]。大量研究表明，黄芪多糖可有效抑制AngⅡ对心肌造成的损伤[12-14]。但黄芪多糖对AngⅡ造成的足细胞损伤的影响还鲜有报道。本研究中，黄芪多糖可以有效抑制AngⅡ对足细胞活性的影响，这说明保护足细胞免受外界因素的刺激是黄芪多糖治疗慢性肾病的机制之一。通过对足细胞内Ca2+浓度的研究发现，黄芪多糖可以显著抑制Ang Ⅱ引起的足细胞内Ca2+的升高。有研究指出，AngⅡ造成的足细胞损伤与Ca2+内流显著相关，在该过程中涉及了门通道蛋白NMDA受体和TRPC6的变化[15]。有研究表明，给小鼠注射AngⅡ诱发高血压，可以上调NMDA受体亚基NR1的表达[16]。研究指出，NMDA受体中的NR1亚基参与了叶酸诱导的小鼠急性肾损伤，叶酸通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活了小鼠中的NMDA受体，使Ca2+大量进入肾细胞，从而导致了ROS的产生[17]。有研究报道，在糖尿病肾病大鼠模型中，AngⅡ是以依赖TRPC通道的方式引起足细胞凋亡的[18]。TRPC6已经成为足细胞是否发生损伤的决定因素，TRPC6可以介导足细胞中Ca2+流入的增加，并通过钙依赖的途径启动足细胞的程序性死亡。在本实验中，黄芪多糖对受到AngⅡ刺激的足细胞中NMDA受体亚基NR1的基因表达无显著的抑制作用，却能显著抑制另外一个钙通道蛋白TRPC6基因的表达。有研究报道，AngⅡ对TRPC6的激活依赖ROS的产生，如导致肾脏中H2O2的急性释放[19]。又有研究报道，ROS可以通过MAPK信号通路抑制Nephrin的表达[20]，而Nephrin可以依赖性的通过酪氨酸磷酸化途径抑制TRPC6的过表达，从而抑制肾小球硬化症的发生[21]。本实验研究结果发现，黄芪多糖可以显著抑制AngⅡ引起的足细胞ROS的增加，并显著提高细胞内Nephrin的含量。由此推测，在AngⅡ造成大鼠肾损伤的过程中，同时伴随着NMDA受体和TRPC6蛋白两个离子通道的激活，Ca2+的大量内流抑制了PI3K基因的表达，上调了细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达，启动了足细胞的凋亡程序。在这一过程中，TRPC6可能位于NMDA受体调控的下游，NMDA受体介导了Ca2+的内流，从而增加了细胞内ROS的含量，使细胞内的Nephrin受到抑制，使TRPC6出现过表达，从而加速了Ca2+的内流。而黄芪多糖并未对NMDA受体和TRPC6直接进行调控，而是通过抑制细胞内ROS的增加，上调了细胞内Nephrin的含量，从而抑制了TRPC6的过表达对足细胞造成的损伤。但也有研究表明，NMDA受体的过表达同样也会引起肾脏的纤维化、急性肾损伤和肾小球疾病[22]。所以说，仅对TRPC6进行抑制并不能阻止AngⅡ通过NMDA受体途径对足细胞造成的损伤。在神经细胞的研究中发现，TRPC6可以上调Calcineurin的含量，而Calcineurin对NMDA受体的功能具有抑制作用[23]。在本次对足细胞的研究中发现，黄芪多糖在抑制TRPC6表达的同时，NR1受体并没有显著增加，这可能是因为黄芪多糖抑制了TRPC6的表达，但并未对TRPC6通过Calcineurin途径对NMDA受体的反馈调节进行显著抑制，从而有效避免了Ang Ⅱ通过NMDA受体途径对足细胞造成的损伤。

本研究结果表明，黄芪多糖可以通过其抗氧化功能，抑制AngⅡ刺激后足细胞内ROS的增加，从而抑制TRPC6过度表达引起的Ca2+大量内流，进而抑制了由Ca2+介导的细胞凋亡，从而对足细胞起到了保护作用。与此同时，黄芪多糖并未对TRPC6的反馈调节通道产生显著抑制，从而阻止了AngⅡ通过NMDA受体途径对足细胞造成的损伤。