复方栀子金花清热泻火药理作用研究

孙延平，刘艳，刘源，刘宇萌，肖宗雨，赵东颖，杨炳友，匡海学

(黑龙江中医药大学 北药基础与应用研究教育部重点实验室，黑龙江省中药及 天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

现代医学认为“上火”是一种亚健康状态，是受到气候、饮食、情志、劳倦过度、不良生活习惯等因素的影响而产生的。近年来，出现“上火”状态的患者数量呈增长势态，如能及时进行调理，可迅速解除“上火”的状态，使身体达到新的平衡。但若“上火”的状态持续存在，就有可能进一步发展为临床病症[1]，在给生活带来不便的同时也给身心造成一定的损害。复方栀子金花始载于《宣明论方》[2]，为经典的清热泻火复方，由栀子、黄连、黄芩、黄柏、大黄、金银花、知母、天花粉等组成，用于肺胃热盛，口舌生疮，牙龈肿痛，目赤眩晕，咽喉肿痛等症[3-4]。然而复方栀子金花是如何发挥清热泻火的作用机制目前仍不明晰。本研究采用拘束应激大鼠模型和小鼠耳肿胀模型，通过考察动物状态、胸腺及脾脏指数，测定血清中ALT、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8的含量，肝组织中MDA、NO、XOD的含量和ORAC及血清中总抗氧化能力T-AOC，明确栀子金花清热泻火的作用，并初步明晰其可能的作用机制，为其传统功效提供现代药理学的科学依据。

1 材料

1.1 实验仪器

可见分光光度计(Thermo scientific公司)；酶标仪VICTOR X3型(PerkinElmer公司)；水浴锅HHS型(上海博讯实业有限公司)；离心机(Micro公司)；旋转蒸发仪(Buchi公司)。

1.2 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠,体质量(180±20)g和雄性KM小鼠,体质量(20±2)g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(黑)2015001。实验室标准条件适应饲养1周后开始实验。

1.3 实验试剂与药品

栀子(北京同仁堂，批号18100361)、黄连(北京同仁堂，批号18903340)、黄芩(北京同仁堂，批号17120071)、黄柏(北京同仁堂，批号18230012)、大黄(北京同仁堂，批号17330014)、金银花(北京同仁堂，批号17070428)、知母(北京同仁堂，批号18100041)、天花粉 (北京同仁堂，批号17070026)，ALT、MDA、NO、XOD、ORAC、T-AOC、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8试剂盒 (南京建成生物工程研究所)，生理盐水 (哈尔滨三联药业股份有限公司)，20%脂肪乳剂 (四川科伦药业股份有限公司)，冰醋酸 (天津市富宇精细化工有限公司)，二甲苯 (上海江莱生物科技有限公司)，阿司匹林 (南京白敬宇制药有限责任公司)。

2 方法

2.1 对拘束应激大鼠模型的影响

2.1.1 药品制备

复方栀子金花提取物的制备：根据2015版《中华人民共和国药典》中栀子金花丸复方比例称取各味药，44倍量29%乙醇，回流提取3次，每次3 h，合并提取液，浓缩至无醇味，冷冻干燥即得。

2.1.2 造模与给药

采用拘束应激大鼠模型模拟机体“上火”状态[5]。拘束应激模型是以剥夺大鼠身体自由活动为模型，将大鼠置于拘束模型中，连续拘束21 d，每天拘束6 h(9:30—15:30)[6]。每天于造模前30 min给各组大鼠灌胃[7]。

将健康大鼠40只，随机分成空白对照组，模型组，复方栀子金花低、中、高剂量组 (0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg) 共5组，每组8只。空白对照组和模型组均予以同体积生理盐水。

2.1.3 样品的收集

大鼠按1 mL/100 g尾静脉注射10%脂肪乳剂生理盐水稀释液，35 min后腹腔注射10%戊巴比妥钠麻醉，沿腹中线用无菌剪刀剖腹，取出肝脏、胸腺和脾脏，腹主动脉取血，静置1 h后离心 (5 000 r/min，5 min)，取上清液即血清备用。

2.1.4 考察指标

21 d后观察大鼠体毛颜色、光泽度，精神状态，体质量变化等。第22天对大鼠尾静脉注射10%脂肪乳剂，35 min后麻醉，麻醉后取胸腺和脾脏称重，按照公式：免疫器官指数=[免疫器官重量(g)/大鼠体质量(g)]×100%计算免疫器官指数[7]；取肝组织0.4 g，加入9倍体积生理盐水，冰浴条件下研磨成10%匀浆，离心，按试剂盒法测定肝组织中过氧化脂质NO、MDA、XOD、ORAC含量；并腹主动脉取血，静置1 h后离心 (5 000r/min，5 min)，取上清液按试剂盒法测定血清中ALT、TG、SOD、GSH-PX、IL-2、IL-3的含量及总抗氧化能力T-AOC[8]。

2.2 对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型的影响

2.2.1 样品制备 同2.1.1。

2.2.2 造模与给药

小鼠连续灌胃给药7 d后，末次给药30 min后，除空白组外，每只小鼠右耳廓两面涂抹浓度50 μL 100%二甲苯致炎，左耳对照[9-10]。将健康雄性KM小鼠48只，随机分成空白组，模型组，阿司匹林阳性对照组 (0.75 g/kg)，复方栀子金花低剂量组(0.3 g/kg)、中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(1.2 g/kg)，共6组，每组8只。空白组和模型组均予以同体积的生理盐水。

2.2.3 考察指标

致炎后30 min，将小鼠脱臼处死，剪下左右两耳片，用6 mm直径打孔器，分别在同一部位打下圆耳片，用电子天平称两耳片的重量，肿胀度为两耳片的重量差，耳片肿胀率计算公式如下：肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%[11]；所得到的小鼠耳组织放入10%福尔马林中固定，耳组织经脱水、包埋、切片、脱蜡、尹红-苏木精(HE)染色，封固后将标本置于显微镜下并选择合适具有代表性的区域观察拍照(20×)；致炎后1 h眼球取血，离心(3 000 r/min，5 min)，取上清液，按照试剂盒说明测试小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 对拘束应激大鼠状态的影响

与空白组相比，模型组大鼠精神萎靡，毛发凌乱、干枯毛躁，灌胃和束缚时反抗剧烈，且体质量增长缓慢。与模型组相比，复方栀子金花中、高各剂量组的大鼠精神状态较好，体毛较整洁且光泽度好。

3.2 对拘束应激大鼠免疫器官指数的影响

与空白组相比，模型组大鼠的脾脏和胸腺出现萎缩，脾脏指数具有显著性差异(P<0.05)，胸腺指数具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，栀子金花低、中、高剂量组可以显著提高大鼠脾脏指数(P<0.05)；栀子金花高剂量组可以显著提高大鼠胸腺指数(P<0.05)，结果见表1。

表1 栀子金花对拘束应激大鼠免疫器官指数的影响

3.3 对拘束应激大鼠肝组织中NO、MDA、XOD、ORAC含量和血清ALT、T-AOC、IL-2、IL-3和TG清除率含量的影响

与空白组相比，模型组大鼠肝组织中NO、MDA、XOD和血清ALT的含量、TG清除率明显增高(P<0.01)，与模型组相比，栀子金花中、高剂量组可以极显著降低大鼠肝组织中NO、MDA、XOD和血清ALT、TG的含量(P<0.01)；与空白组相比，模型组大鼠肝组织中ORAC和血清T-AOC、IL-2、IL-3降低，且具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，栀子金花中、高剂量组可以显著提高ORAC、T-AOC、IL-2和IL-3(P<0.05)，结果见表2和3。

表2 栀子金花对拘束应激大鼠肝组织中NO、MDA、XOD、ORAC的影响

3.4 对小鼠耳肿胀度的影响

如表4所示，与空白组相比，模型组局部给予二甲苯后，小鼠的耳肿胀度具有极显著差异(P<0.01)，表明造模成功；给药后，与模型组比较，阳性药组能够明显降低小鼠耳肿胀度，肿胀抑制率具有统计学意义(P<0.01)，复方栀子金花中、高剂量组能够降低小鼠的耳肿胀度，且肿胀抑制率具有显著性差异(P<0.05)。

3.5 对耳肿胀小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠血清中TNF-α的含量增高(P<0.05)，IL-1β、IL-6、IL-8的含量明显增高(P<0.01)；与模型组相比，阳性药组能够显著降低小鼠血清中TNF-α、IL-8的含量(P<0.05)和IL-1β的含量(P<0.01)，栀子金花中、高剂量组能够不同程度地降低小鼠血清中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6的含量(P<0.01，P<0.05)，结果见表4。

表3 栀子金花对拘束应激大鼠血清中ATL、T-AOC、IL-2、IL-3、TG的影响

表4 复方栀子金花对二甲苯诱导小鼠耳肿胀度的影响

3.6 对小鼠肿胀耳组织形态学的影响

苏木精和伊红对小鼠耳组织染色(HE)，观察各组小鼠耳组织的炎症水肿和淋巴细胞浸润程度。如图1中HE染色结果所示，与正常组小鼠耳组织相比(图1a)，给予二甲苯刺激的小鼠耳组织有明显的水肿、充血、肌肉松散和淋巴细胞浸润现象(图1b)。与模型组相比，阳性药组、复方栀子金花低、中、高剂量组(图1c～f)能够改善小鼠耳组织的水肿和淋巴细胞浸润现象。

注:a,正常组;b,模型组;c,阳性药组;d,低剂量组;e,中剂量组;f,高剂量组。图1 二甲苯诱导的小鼠耳组织的HE染色(×400)

4 讨论

“上火”是一种应激性生理反应，是机体受到应激因素刺激引起的一种稳定及维持机体内环境的适应能力，从“上火”到形成疾病是一种包含中枢、内分泌及免疫系统的应激负荷反应过程。当机体处于应激负荷时，体内活性氧自由基生成增加，破坏脂肪酸链和细胞膜完整性，使胞浆内ALT渗出[12]，过量生成的NO可以与超氧阴离子直接或间接作用产生过氧化亚硝酸盐，导致脂质过氧化，生成脂质过氧化产物MDA。同时，当机体受到外界刺激，巨噬细胞便会释放出多种与炎症和免疫应答密切相关的细胞因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等[13]。本实验首次采用拘束应激大鼠模型和二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型，考察复方栀子金花清热泻火功效的药理学作用及其作用机制。实验结果显示，复方栀子金花可以明显抑制拘束应激所致的免疫器官指数的降低，降低拘束应激大鼠ALT、NO、MDA的含量，显著提高其T-AOC、ORAC指数、TG清除率、GSH-PX活力和IL-2含量，改善二甲苯诱导的小鼠耳肿胀度，显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

综上所述，复方栀子金花发挥清热泻火的药理作用机制可能是与改善脂代谢紊乱、缓解氧化应激状态以及降低炎症反应等相关。该研究不仅为复方栀子金花的作用机制、药效物质基础、质量评价等进一步研究提供了理论依据，也为“上火”相关发生机制的深入研究奠定了实验基础。