NLRP3 的过度激活与ARDS和损伤性机械通气诱导的肺损伤的关系

刘 军 石 颖 王婷婷 左祥荣

南京医科大学第一附属医院重症医学科，江苏南京 210029

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是急性弥漫性损伤导致的急性缺氧性呼吸衰竭。在全世界，每年约有300 万ARDS 患者，占重症监护病房住院人数的10%[1-2]，院内死亡率仍然高达46.1%[3]。机械通气是ARDS 的有效治疗手段之一，但它是一把“双刃剑”，可能会导致呼吸机相关性肺损伤（VILI）[4-5]。机械牵张刺激肺泡上皮细胞，激活肺泡巨噬细胞等炎症细胞，释放大量炎性因子，导致失控性“瀑布样”炎症反应[6]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的是一种由传感器蛋白NLRP3、接头蛋白ASC 和效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-1 组成多蛋白复合物，可被病原体相关分子模式或损伤相关分子模式激活，如细菌、病毒和ATP 等[7-9]。NLRP3 过度激活也会导致组织损伤和器官功能障碍[10]。研究表明NLRP3炎症小体在ARDS 或VILI 中发挥了重要作用[11-13]。但既往研究通常使用40 mL/kg 的潮气量诱导肺损伤，远超过临床常用量[6]。在动物模型中，20 mL/kg 是造成肺损伤较为合适的潮气量[14]。本研究拟以潮气量为20 mL/kg 来模拟损伤性机械通气，探讨NLRP3 过度激活是否参与ARDS 和损伤性机械通气诱导的肺损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物及ARDS 模型的制备

清洁级雄性SD 成年大鼠50 只，体重（330±20）g，购于南京医科大学实验动物中心[SCXK（苏）2016-0002]。饲养于南京医科大学动物中心，饲养温度（23±2）℃，湿度（40±5）%，普食饲养，自由饮水。本研究经过南京医科大学动物伦理委员会批准（审批号：IACUC-1905030）。取10 只SD 大鼠按随机数字表法分为生理盐水（NS）组和油酸（OA）组。OA 组颈静脉注入OA（0.1 mL/kg）制备ARDS 模型[15-16]，NS 组注入等量生理盐水。2 h 后通过氧合指数，肺损伤评分和肺湿干重比（W/D），确定造模成功。

1.2 实验分组及处置

另取40 只大鼠按随机数字表法分为对照组（n=10）、OA 组（n=30）。大鼠麻醉后行气管切开插管，2 h后开始机械通气，OA 组按通气方式不同分为ARDS组、小潮气量组（Vt=6 mL/kg）、损伤性通气组（Vt=20 mL/kg）。对照组和ARDS 组大鼠保留自主呼吸。其余两组机械通气4 h（吸入氧浓度为21%，呼吸频率为80 次/min，吸呼比为1∶2）。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 血气分析 将大鼠麻醉（腹腔注射2%戊巴比妥钠），经左颈动脉置管并固定。在麻醉后2、3、4、5 h 和6 h 采集左颈动脉血行血气分析，记录pH 值、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、并根据测得氧分压和吸入氧浓度计算氧合指数。

1.3.2 肺湿/干重比（W/D）及肺病理学损伤评分 颈椎脱位法处死大鼠取右肺称湿重，随后在60℃的烤箱中干燥72 h 称干重，计算W/D。分离出左肺洗涤后用4%多聚甲醛固定，HE 染色。按随机双盲原则，由3 名病理医师按美国胸科学会的肺损伤评分标准[17]进行评分。

1.3.3 Western blot 取肺组织加入裂解液（含蛋白酶和酸酶抑制剂）提取总蛋白。采用BCA 试剂盒（碧云天，中国，P0010）测定总蛋白浓度。取等量蛋白质（30 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上。用5%的脱脂牛奶进行封闭2 h，4℃一抗孵育过夜。所用一抗如下：NLRP3（1∶1000 Abcam UK，ab263899），Caspase-1（1∶1000 Invitrogen USA，MA5-32137），IL-1β（1∶3000 Abcam UK，ab9787），IL-18（1∶3000 Abcam UK，ab191860），and GAPDH（1∶1000 Cell Signaling Technology USA，97166S）。洗涤后，膜与二抗（1∶1000，碧云天，中国，A0208）室温下孵育1 h。ECL 发光液处理Western blot 条带后，使用GelDox XR系统（Bio-Rad，CA，USA）成像。

1.3.4 RT-PCR 检测NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 的mRNA 表达 从肺组织中提取总RNA，反转录合成cDNA。RT-PCR 扩增cDNA 反应体系为25 μL（2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L 基因引物2.0 μL，反转录产物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL），扩增条件：95℃热启动10 min 后；95℃30 s，58℃退火延伸30 s，共40 循环。每份样本重复检测3 次，取平均Ct 值，用相对定量法（2-△△Ct）计算各组小鼠目的基因表达。引物序列如下：NLRP3 正向引物为5’-CAGACCTCCAAGACCACGACTG-3’，反向引物为5’-CATCCGCAGCCAATGAACAGAG-3’。Caspase-1 正向引物为5’-ACTGAACAAAGAAGGTGGCG-3’，反向引物为5’-CAAGACGTGTACGAGTGGGTG-3’。IL-18 正向引物为5’-GACTGGCTGTGACCCTATCTGTGA-3’，反向引物为5’-TTGTGTCCTGGCACACGTTTC-3’。IL-1β 正向引物为5’-CTGTGACTCGTGGGATGATG-3’，反向引物为5’-AGGGATTTTGTCGTTGCTTG-3’。GAPDH 正向引物为5’-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC-3’，反向引物为5’-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC-3’。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t。两组比较采用t 检验。重复测量数据采用双因素重复测量方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARDS 模型判定

注入OA 2 h 后，OA 组氧合指数低于NS 组，肺损伤评分、W/D 比高于NS 组（P ＜0.01），见表1。肺组织HE 染色可见OA 组大鼠肺泡腔内有淡红色均质状水肿液渗出，肺泡间隔增厚，红细胞及中性粒细胞浸润，见图1。

图1 OA 注射2 h 后两组大鼠肺组织病理变化（HE，200×）

表1 油酸注射2 h 后两组大鼠氧合指数、肺损伤评分、W/D 比较（）

表1 油酸注射2 h 后两组大鼠氧合指数、肺损伤评分、W/D 比较（）

注：NS：生理盐水；OA：油酸；W/D：肺湿/干重比。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 各组大鼠血气参数和肺损伤

整体分析发现，麻醉后2、6 h，ARDS 组pH 和氧合指数均低于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见图2A。麻醉后6 h，损伤性机械通气组pH和氧合指数低于ARDS 组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），图2A。麻醉后6 h，小潮气量组氧合指数和pH 高于ARDS 组（P ＜0.05），见图2A。整体分析发现，麻醉后2 h PaCO2组间比较，差异无统计学意义（均P ＞0.05），见图2A。麻醉后6 h，小潮气量组PaCO2高于ARDS 组，ARDS 组PaCO2高于对照组和损伤性通气组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见图2A。麻醉后6 h，ARDS 组肺损伤评分和W/D 高于对照组；损伤性通气组高于ARDS 组，小潮气量组低于ARDS 组（均P ＜0.001），见表2。

表2 各组大鼠肺损伤评分及W/D 比较（）

表2 各组大鼠肺损伤评分及W/D 比较（）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与ARDS 组比较，bP ＜0.01；与小潮气量组比较，cP ＜0.01。ARDS：急性呼吸窘迫综合征；W/D：肺湿干重比

图2 各组大鼠血气参数及肺组织HE 染色（200×）

2.3 各组大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 表达

ARDS 组NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 蛋白表达高于对照组；损伤性通气组高于ARDS 组；而小潮气量组和ARDS 组比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图3。ARDS 组NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β mRNA 的表达高于对照组（P ＜0.05）。损伤性通气组高于ARDS 组（P ＜0.05），而小潮气量组与ARDS组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β 相对表达量比较（）

表3 各组大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β 相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与ARDS 组比较，bP ＜0.05；与小潮气量组比较，cP ＜0.05。NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；Caspase-1：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1；IL-18：白细胞介素18；IL-1β：白细胞介素1β；ARDS：急性呼吸窘迫综合征

图3 蛋白质免疫印迹试验检测各组大鼠肺泡巨噬细胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-18 的蛋白表达

3 讨论

本研究通过右侧颈静脉注射OA 成功制备了ARDS 模型[18]。本研究结果显示损伤性机械通气和ARDS 均可使肺组 织中NLRP3、Caspase-1、IL-18 及IL-1β 表达增加，并且上述指标的高表达与肺损伤具有相关性。

NLRP3 炎症小体通过活化Caspase-1，促使pro-IL-β 和pro-IL-18 裂解、成熟、释放，参与先天免疫防御，是机体固有免疫系统的重要组成部分[19]。活性氧（ROS）是激活NLRP3 的重要途径，ARDS 会使内皮细胞/上皮细胞功能受损产生过多的ROS[20-21]。本研究中，ARDS 组肺组织中NLRP3 表达高于对照组，并且Caspase-1 活化表达增加，其下游的IL-1β、IL-18 表达也增加，提示ARDS 可诱导NLRP3 活化。另外，损伤性机械通气可以提高肺泡巨噬细胞中ROS 的表达水平[22]，机械牵张也会直接激活肺泡巨噬细胞中的NLRP3[23]。本研究提示损伤性通气组的NLRP3 表达水平高于ARDS 组，并且肺损伤更严重。这可能是因为损伤性通气导致NLRP3 过度激活，引起由炎性介质、细胞因子和炎症细胞参与的生物损伤。而小潮气量组肺损伤较轻，可能与改善氧合抑制ROS 产生，减少对肺的过度牵张有关。这些结果提示损伤性通气和ARDS 都可激活肺组织中的NLRP3，并且损伤性机械通气NLRP3 过度激活。一旦NLRP3 被激活会导致Casepase-1、IL-1β、IL-18 表达升高。IL-1β 在急性肺损伤的发展中起着关键作用，可促使转化生长因子-β表达增加，后者是炎症和纤维化的标志[24]。有研究提示急性肺损伤的病症严重程度与IL-18 水平有直接关联[25]。Western blot 及RT-PCR 证实，与ARDS 组相比，损伤性通气组IL-1β、IL-18 的表达水平更高，病理分析提示肺损伤更严重。这就提示损伤性通气使NLRP3 过渡激活，释放大量炎症因子，加重了ARDS肺损伤。

综上所述，NLRP3 炎症小体激活与ARDS 所致肺损伤相关。在ARDS 基础上，损伤性通气进一步增加了NLRP3 及其下游炎症因子IL-1β、IL-18 的表达，提示损伤性通气可能通过过度激活NLRP3 加重ARDS 大鼠肺损伤，而小潮气量通气可以避免过度激活NLRP3炎症小体，可能是其发挥肺保护作用的机制之一。