降钙素受体基因多态性与昆明地区2型糖尿病伴骨质疏松症的相关性

2021-07-29李博一苗翠娟韩竺君

昆明医科大学学报 2021年7期

李博一，牛玲，马蓉，张娴，刘方，唐艳，苗翠娟，韩竺君，张程

（昆明市第一人民医院内分泌科，云南昆明 650011）

随着人们生活水平的提高和寿命的延长，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus）和骨质疏松症的发病率逐年上升，据国际糖尿病联盟（international diabetes federation，IDF）预计2030年T2DM发病率将翻倍，而中国T2DM将达到4 230万人，骨质疏松症的发病率也已跃居各种常见病的第7位，已成为全球主要的公共卫生问题[1]。在众多的发病因素中，遗传是T2DM和骨质疏松症主要的发病原因，有研究认为，糖尿病性骨质疏松是一种多基因遗传病，这些基因[2]包括降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）基因，维生素D受体基因及护骨素基因等。对CTR基因型多态性与骨质疏松症的相关性，国内外研究结果尚不一致。CTR基因型与T2DM伴骨质疏松症的关系研究较少。本研究旨在探讨CTR基因多态性与昆明地区T2DM伴骨质疏松症的相关性，持续为昆明地区T2DM伴骨质疏松症防治提供理论依据，并早期防治糖尿病性骨质疏松，提高糖尿病患者的生活质量。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民医院甘美医院内分泌科住院的2型糖尿病患者237例。糖尿病诊断标准：参考2013年版《中国2型糖尿病防治指南》[3]；骨质疏松诊断标准：参考2011年版《原发性骨质疏松症诊治指南》[4]。纳入标准：（1）T2DM；（2）昆明地区居住时间大于10 a。排除标准：（1）1型糖尿病；（2）各种糖尿病急性并发症、感染、营养不良及严重的心肝肾脏疾病及肿瘤患者；（3）甲状腺手术史，合并其他可能引起甲状腺激素代谢异常的其他内分泌、免疫系统疾病、结缔组织病者，如垂体瘤、垂体功能减退者，亚急性甲状腺炎等；（4）皮肤疾病无法接受阳光照射者；（5）存在风湿或类风湿关节炎，且应用激素类药物时间超过6个月，或曾经接受活性维生素D、降钙素、雌激素受体调节剂等影响骨代谢的药物治疗者；（6）存在畸形性骨关节炎者和成骨不全患者。按骨密度检测结果分组为糖尿病无骨质疏松症（A组）61例，占25.7%；糖尿病合并骨量减少组（B组）111例，占46.8%；糖尿病伴骨质疏松组（C组）65例，占27.4%。男性122例，女性115例，年龄50～84岁，平均年龄（64.68±7.92）岁。纳入研究对象均签署知情同意书，且本研究经昆明市第一人民医院医学伦理学委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指标测试当日由专人用固定体重身高测量仪测定：体重、身高、计算BMI，记录年龄、性别、糖尿病的病程。

1.2.2 血压测定采用汞柱式标准袖带血压表，休息5 min 后测定坐位右上臂收缩压（SBP）/舒张压（DBP），单位mmHg，（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.2.3 其他生化指标测定受试者隔夜禁食8～12 h，清晨取静脉血测FPG、HbA1c、肝肾功能电解质（血钙）、血脂、UA、维生素D浓度、雌激素水平、睾酮水平，Hs-CRP、FIB。按标准方法行OGTT试验，检测OGTT-0 h、2 h血糖，采用化学发光法测定0 h、2 h INS水平，并计算HOMA-IR。

1.2.4 外周血基因组DNA提取空腹采集静脉血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，标本收集结束后购进DNA提取试剂盒统一提取CTR基因。具体所需试剂及仪器见表1。

1.2.5 PCR扩增（1）扩增所使用的引物：上游引物5′-CTCAGTGATCACGATACTGTG-3′；下游引物5′-TTCAGT GGAACCAGCGTTGG-3′；（2）PCR反应体系：共25 μL，包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，硕擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，硕擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反应条件：共35个循环，95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反应完成后，72 ℃再延伸10 min。

1.2.6 酶切鉴定基因型PCR扩增产物用AluⅠ内切酶酶切后，置于2%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察基因型。

1.2.7 骨密度测量采用通用电气医疗系统（中国）有限公司生产的双能x线骨密度仪（型号DPX Bravo）测量腰椎L1-L4，股骨颈及髋部骨密度（BMD），单位g/cm2。

1.3 统计学处理

本研究的所有数据均使用SPSS11.5软件包进行统计处理。采用Hardy-Weinberg平衡检测基因型的分布是否具有代表性。正态分布计量资料用均数±标准差（）表示，3个独立样本比较，采用方差分析，组间比较用最小有意义差异法（LSD检验）。2个独立样本比较，采用t检验。非正态分布计量资料用M（P25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistic回归分析筛选独立危险因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组人群一般资料比较

结果显示：3组患者年龄、身高、体重、BMI比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 研究对象的一般资料比较[（），M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study subjects [（），M（P25，P75）]

总体比较：*P＜0.05；两两比较：与A组比较，#P＜0.05；与B组比较，&P＜0.05。

2.2 CTR基因型和等位基因频率的分布

2.2.1 CTR基因型酶切电泳图CTR基因AluI酶切位点多态性确定为：CC 型228 bp；CT 型228 bp和120 bp；TT 型120 bp，见图1。

图1 CTR基因型酶切电泳图Fig.1 CTR genotype digestion electrophoresis diagram

2.2.2 CTR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明所选人群代表性好。在237例人群中，CTR基因型分布情况为：CC型181例（76.4%），CT型56例，（23.6%），TT型未检出。提示昆明地区2型糖尿病患者中，CTR基因型以CC型为主，未见TT型。在65例糖尿病合并骨质疏松组中CTR基因型分布情况为：CC型49例（75.4%），CT型16例（24.6%），TT型未检出。提示昆明地区2型糖尿病合并骨质疏松中，CTR基因型仍以CC型为主，未见TT型。

2.2.3 3组人群CTR基因型分布频率比较结果显示：TT基因型在人群中均未检出，CTR基因型CC、CT无统计学差异（P＞0.05），见表3。

表3 CTR基因型分布频率比较[n（%）]Tab.3 Comparison of CTR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3组人群CTR等位基因分布比较结果显示：等位基因C、T的分布频率无统计学差异（P＞0.05），见表4。

表4 CTR等位基因分布频率Tab.4 CTR allele frequency distribution

2.2.5 CTR基因多态性与T2DM患者BMD的关系结果显示：237例T2DM患者中，CTR不同基因型在各部位的BMD值差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表5 CTR基因多态性与T2DM患者BMD的关系[（g/cm2），（）]Tab.5 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.2.6 CTR基因多态性与T2DM伴骨质疏松症患者BMD的关系结果显示：65例T2DM伴骨质疏松症患者中，CTR不同基因型在各部位BMD值差异无统计学意义（P＞0.05），见表6。

表6 CTR基因多态性与T2DM伴骨质疏松症患者BMD的关系[（g/cm2），（）]Tab.6 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients with osteoporosis [（g/cm2），（）]

2.2.7 T2DM伴骨质疏松患者多因素Logistic回归分析结果将CTR基因型（1为CC型，2为CT型）及单因素分析3组间具有统计学差异的变量，即性别（0为女，1为男）、年龄、舒张压、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮作为因变量，糖尿病有无骨质疏松（0为无，1为有）作为自变量，进行多因素Logistic回归分析，以筛选糖尿病伴骨质疏松的独立危险因素。结果显示：年龄（OR1.112、95%CI：1.034～1.196、P=0.004）可以进入回归方程，见表7。

表7 Logistic回归分析结果Tab.7 Logistic analysis results

参考类别说明：“CTR基因型”中的CC型，“性别”以女性，“糖尿病有无骨质疏松”以糖尿病无骨质疏松作为参考类别。

3 讨论

T2DM是一种严重的高风险疾病，除血糖升高外，心、脑、眼、肾、神经等全身并发症是T2DM致死、致残、致盲的主要原因。有研究表明，与糖尿病有关的并发症中如丧失的视力均可增加骨折风险[5]。

T2DM伴骨质疏松症发病机制非常复杂，近年来各国学者对T2DM与骨质疏松症的相关性研究日益增多，目前认为发病机制除了与年龄、性别、体重、营养、生活方式有关外，环境和遗传因素亦起着重要作用。对CTR基因多态性的研究在国际上已经引起了重视，CTR基因多态性与骨质疏松的相关性已有大量报道，而CTR基因多态性与T2DM并骨质疏松症的相关性研究在国内外报道较少。

本研究中的一般临床资料显示：从T2DM无骨质疏松症组到T2DM合并骨量减少组再到T2DM伴骨质疏松组年龄呈逐渐增加趋势，且不论是总体比较还是两两比较有统计学意义，说明随着年龄的增长，T2DM患者患骨质疏松症的风险增加，且Logstic回归分析显示：年龄是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素，说明昆明地区T2DM伴骨质疏松症的发病与年龄相关。BMI无论3组比较还是两两比较差异具有统计学意义，提示伴随BMI降低，昆明地区T2DM患骨质疏松症的风险增加。高BMI一度被认为是T2DM骨密度的保护性因素[6]。原因可能是：（1）BMI较高，在重力作用下骨骼机械负荷增加，有助于维持骨量[7]；（2）脂肪组织较为发达，使雄激素向雌激素转换，骨吸收作用减少[8]；（3）脂肪细胞分泌脂联素、瘦素等脂肪因子，脂联素可以促进骨形成，瘦素下调RANKL活性，抑制破骨细胞分化及骨吸收，同时瘦素还能促进成骨细胞增殖、分化和活性[6]。所以适当增加体重对防治T2DM并发骨质疏松有积极的意义。

CTR不同等位基因的检出率在不同种族和地域存在差异。本研究发现昆明地区T2DMCTR基因型分布频率为：CC型76.4%、CT型23.6%，TT型未检出；T2DM伴骨质疏松CTR基因型分布频率为：CC型75.4%，CT型24.6%，TT型未检出。这与北京[9]、广州[10]研究结果相近似，与台湾[11]、日本地区[12]的研究结果亦相似。Masi等[13]对意大利、Bandres等研究结果显示CTR基因多态性基因型的分布频率与高加索人群非常接近（从高到低依次是CT、TT、CC），与亚洲人不同。

本研究中，A组CTR基因型分布频率分别为CC型80.3%、CT型19.7%、TT型 0%、B组CTR基因型分布频率分别为CC型74.8%、CT型25.2%、TT型0%、C 组CTR基因型分布频率分别为CC型75.4%、CT型24.6%、TT型0%，3组基因型分布频率比较，CTR3种基因型CC、CT、TT的分布频率及等位基因分布频率差异无显著统计学意义。这种多态性分布表明种族、饮食、生活习惯对遗传因素的影响可能与同一种族产生相同的基因频率有关，而与伴随疾病T2DM及T2DM合并骨质疏松症可能无关。

笔者将CTR基因型及单因素分析3组间具有统计学差异的变量作为因变量，糖尿病合并骨质疏松作为自变量，进行多因素Logistic回归分析，以筛选糖尿病合并骨质疏松的独立危险因素，本研究显示年龄是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素，CTR基因型未进入回归方程，说明CTR基因型未增加T2DM人群患骨质疏松症的风险，CTR基因型与昆明地区T2DM及 T2DM伴骨质疏松症遗传易感性不相关。同时比较T2DM患者CTR基因型中不同部位的骨密度，结果显示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差异无统计学意义，提示CTR基因型可能不是T2DM患者BMD改变的易感基因，这与杨军等[7]研究相符。而对于糖尿病伴骨质疏松的患者，笔者也比较了CTR基因型在不同部位的骨密度，结果显示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差异无统计学意义，说明T2DM和骨质疏松症受多个基因调控，多个易感基因组合构成了该病的遗传易感性，每个单一基因在遗传易感性中所起的决定作用不同，因此导致了CTR 基因多态性与T2DM和T2DM合并骨质疏松症患者BMD相关性的不同。

总之，T2DM和骨质疏松症均是多因素疾病，相关的候选基因有很多，单一基因的作用是有限的，CTR基因的多态性是其核苷酸序列1 377处的C突变为T，它的突变可能是影响其与其配体的结合和改变受体信号转导系统从而调节疾病发生发展，具体病理生理机制还不太清楚。CTR基因多态性与T2DM伴骨质疏松症的相关性研究一方面有助于从分子水平解释T2DM伴骨质疏松症发病的遗传学机制，另一方面亦可以应用于评估T2DM骨折的危险性。因此，T2DM伴骨质疏松症的相关基因研究应更加广泛和深入，进行多种族、多地域、大样本的研究，并综合考虑诸多因素的协同作用。