不同病原学检测方法对肺结核复治确诊的价值分析

潘育文 肖海浩 汤春梅 张言斌 苏铎华 张 琳 李天义

肺结核是我国最常见的传染病之一，其发病和死亡数长期占据我国法定传染病报告的第二位，2019年全国报告的新发结核病为77.576 4万例，发病率为55.5491/10万[1]。肺结核复发是不容忽视的问题，国内的调查认为肺结核的复发率在5.3%～6.7%左右[2-3]，每年确诊的肺结核复治病例不在少数。肺结核复治病例有其一定的特殊性，由于症状、体征多无特异性，血清学及免疫学检查、胸部影像学检查等很难迅速地做出精准的活动性判断，确定肺结核是否为复治的“金标准”仍是病原学检查。本研究对拟诊为肺结核复治患者的痰或支气管肺泡灌洗液(BALF)标本，进行传统的涂片找抗酸杆菌和分枝杆菌培养，同时进行2种分子生物学快速检测：利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测(Gene Xpert MTB/RIF)和结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测( SAT-TB)，探讨不同病原学检测方法对诊断肺结核复治的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集广州市胸科医院结核内科 2019年1月—12月期间住院收治的拟诊为肺结核复治患者的临床资料。纳入标准：①有咳嗽、咯痰、咯血、胸痛、呼吸困难等呼吸道症状，伴或不伴发热、消瘦等全身中毒症状；②影像学检查结果考虑有肺结核的影像学改变；③既往有肺结核病史，不合理或不规则用抗结核药物≥1月或曾规律抗结核治疗完成疗程；④初治失败；⑤痰或BALF均完成涂片找抗酸杆菌，分枝杆菌培养，Gene Xpert MTB/RIF和SAT-TB检测。排除标准：①初治肺结核；②既往无肺结核病史；③病历资料不完全。

诊断标准：复治肺结核与非活动性肺结核(含非结核分枝杆菌肺病)的诊断参考《WS288-2017肺结核诊断》的标准[4]；非活动性肺结核的其他肺部疾病诊断参考林果为主编的《实用内科学》呼吸系统疾病章节[5]。

1.2 仪器与方法

1.2.1 涂片找抗酸杆菌 根据中国防痨协会2006年版《结核病诊断实验室检验规程》,采用荧光涂片染色镜检法对标本进行涂片染色和镜检。

1.2.2 分枝杆菌培养 使用BectonDickinson公司的BACTEC MGIT 960系统，按照实验说明书标准进行快速液体培养。

1.2.3 Gene Xpert MTB/RIF检测 设备及试剂盒来自于赛沛公司,按照仪器、试剂操作说明书对标本进行检测。

1.2.4 SAT-TB检测 检测试剂盒来自于上海仁度生物科技公司，应用ABI 7300荧光定量 PCR扩增仪进行检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 患者的一般情况

符合标准的患者共323例，其中男242人、女81人，年龄19～87岁，平均年龄(56.08±13.77)岁；最后诊断肺结核复治92例(28.48%)，非活动性肺结核231例(71.52%)，其中支气管扩张并感染76例，肺炎61例，慢性肺曲霉病(Chronic pulmonary aspergillosis，CPA)55例，非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)肺病36例，肺癌3例。

2.2 不同检测方法的检测结果

在肺结核复治确诊病例组中Gene Xpert MTB/RIF的阳性检出率为95.65%，分枝杆菌培养为89.13%,两种方法进行比较，差异无统计学意义(2=2.783 2，P>0.05)；SAT-TB的阳性检出率78.26%,涂片法为69.57%，两种方法进行比较，差异无统计学意义(2=1.803 9P>0.05)；Gene Xpert MTB/RIF和分枝杆菌培养的阳性检出率比SAT-TB和涂片法明显较高(P<0.05)。见表1。

表1 323例患者不同检测方法的结果 [n]

2.3 不同检测方法的诊断效能

以最后确诊肺结核复治作为标准，来评估不同检测方法的效能，结果显示：灵敏度的高低顺序为Gene Xpert MTB/RIF>分枝杆菌培养>SAT-TB>涂片法；特异度的高低顺序为SAT-TB>Gene Xpert MTB/RIF>涂片法>分枝杆菌培养；Youden指数的大小顺序为Gene Xpert MTB/RIF>SAT-TB>分枝杆菌培养>涂片法；阳性预测值的高低顺序为 SAT-TB>Gene Xpert MTB/RIF>涂片法>分枝杆菌培养；阴性预测值的高低顺序为 Gene Xpert MTB/RIF>分枝杆菌培养>SAT-TB>涂片法，见表2。

表2 不同检测方法对肺结核复治确诊的诊断效能 [%]

3 讨论

结核的转归方式，注定了大部分肺结核患者治愈后影像学检查仍保留着结核的特点，当再次出现症状时，影像学检查难以准确区分肺部病灶是否出现活动[6]。对肺结核活动性的判断，常规的CRP、ESR等炎性指标无太多临床意义，而传统的结核菌素皮肤实验(Tuberculin skin test,TST)和近年来广泛开展的结核分枝杆菌特异性γ干扰素释放试验(Interferon gamma release assays,IGRAs)的价值也有限[7-8]。因此病原学检查才是确定肺结核是否复治的金标准，涂片找抗酸杆菌、分枝杆菌培养和分子生物学检测是目前临床广泛开展的结核分枝杆菌检测技术。

涂片找抗酸杆菌在本组研究不同方法中，对肺结核复治确诊病例的阳性检出率最低，灵敏度也是最低，与国内研究报道一致[9]，Youden指数最小，其诊断效能最差。传统的涂片找抗酸杆菌，虽然有简单经济，易于开展的优点，但其缺点也比较明显：阳性率低，无法辨别死菌与活菌，不能区分是MTB还是NTM。近年来随着分子生物学检测手段的发展，涂片阳性的标本可进一步行线性探针技术( LPAs)、荧光 PCR 溶解曲线法、基因芯片技术等检测,通过对结核分枝杆菌核酸能否检出，从而可初步区分MTB或NTM，并对检出的结核分枝杆菌进行异烟肼和利福平等主要抗结核药物的耐药快速检测， 1～2天内可出报告结果[10]，因此涂片找抗酸杆菌对于肺结核复治确诊及治疗方案的制定，仍具有重要的参考价值。

本文的研究结果显示分枝杆菌培养的灵敏度仅次于Gene Xpert MTB/RIF，对肺结核复治确诊病例的阳性检出率也较高，但特异度较差，诊断效能优于涂片，但差于两种分子生物学检测方法。培养仍是目前诊断肺结核的金标准，快速液体法培养较传统的罗氏培养已有明显改进，但平均报告阳性时间也要9．5～10．2 d[11-12]，耗时仍较长，仍很难满足临床的诊疗需要，但培养阳性后可进一步做菌型鉴定区分MTB还是NTM，同时做药敏实验，对最终的确诊，临床用药的选择以及后续耐药性监测等具有其他方法无法替代的作用。本研究中共有36.53%(118/323)的患者培养阳性，其中30.51%(36/118)通过菌型鉴定确定为NTM，因此当可疑肺结核复发患者的培养结果出现阳性时，应注意是否有NTM的可能，应等待最终菌型鉴定结果才能作出最后结论。

临床需要快速、灵敏度和特异度高的病原学检测技术来帮助诊断肺结核是否为复治，近年来发展起来的分子生物学检测技术提供了可能。Gene Xpert MTB/RIF是世界卫生组织唯一推荐用于快速诊断结核的检测方法，以全自动半巢式实时荧光PCR技术为基础，能在2 h内迅速检出结核分枝杆菌，同时确定有无对利福平耐药[13],是目前已知分子生物学检测手段中具有最高灵敏度的方法[14]。本研究Gene Xpert MTB/RIF在肺结核复治确诊病例组中阳性检出率最高，和分枝杆菌培养比较差异无统计学意义(P>0.05)；在四种检测方法中灵敏度和阴性预测值最高，特异度和阳性预测值仅次于SAT-TB，Youden指数最大，反映出其极佳的诊断效能，这与国内外学者所做的研究基本一致[15-17]。本研究中非活动性肺结核也有6.06%(14/231)的患者Gene Xpert MTB/RIF阳性，但检出结核分枝杆菌的浓度均为低或极低，考虑出现假阳性的主要原因是这些既往有肺结核的患者，体内仍存有死菌[18]，也存在标本污染的可能性。Gene Xpert MTB/RIF具有极高的灵敏度，但无法分辨死菌或活菌，因此对于肺结核复治的诊断时应注意，尤其是检出浓度低或极低时应注意是否为死菌的可能。对于初治病例，当涂片阳性，同时Gene Xpert MTB/RIF检测阳性，提示标本存在MTB，可做出活动性结核的诊断[19]，但对于复治病例，必须慎重，应结合临床，综合培养等其他检测手段分析后再做判断。本组非活动性肺结核病例中，36例NTM肺病有50%(18/36)涂片阳性，而同时Gene Xpert MTB/RIF仅有2.78%(1/36)为阳性，提示当涂片找抗酸杆菌阳性，而同时Gene Xpert MTB/RIF检测阴性时，要高度怀疑NTM肺病的可能。

SAT-TB是一种应用恒温RNA扩增和实时荧光技术同时检测临床标本中结核分枝杆菌复合物的方法，可在1.5～2 h内快速确定标本中有无结核分枝杆菌。而 RNA 只存在结核分枝杆菌活菌中，在结核菌死亡后会迅速发生降解，因此SAT-TB检测可有效明确标本中有无存在活菌；同时与NTM等呼吸道病原体没有交叉反应，是一种简便、快捷、具有较高特异性的方法，可提高结核的检出率[20]。本研究中SAT-TB对肺结核复治确诊病例的阳性检出率与涂片法接近(P>0.05)，低于Gene Xpert MTB/RIF和分枝杆菌培养(P<0.05)；在四种检测方法中特异度和阳性预测值最高，Youden指数仅次于Gene Xpert MTB/RIF，说明SAT-TB对肺结核复治的诊断有高度的准确性，具有较好的诊断效能，其灵敏度和阴性预测值低于Gene Xpert MTB/RIF和培养，这与国内对3608例疑似肺结核患者进行SAT-TB检测的大样本研究结果相符[21]。从本研究可看出，当SAT-TB和Gene Xpert MTB/RIF同时阳性时，尤其是Gene Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌浓度为中等以上时，基本可判定为肺结核复治确诊；而SAT-TB为阴性，同时Gene Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌浓度为低或极低时，应注意非活动性肺结核的可能，应联合培养才能作出正确判断。

综上所述，Gene Xpert MTB/RIF具有较高的灵敏度，SAT-TB有较高的特异度，两种分子生物学检测方法对临床快速诊断肺结核复治确诊有着重要的应用价值，涂片和培养作为传统的检测手段，仍具有不可替代的作用，多种方法联合运用，综合临床分析，能对肺结核复治进行快速、准确的诊断。