壳聚糖杂化吴茱萸碱复合纳米粒的药动学研究*

2021-07-29向晓燕余忠姝谢佳希施宇涛张景勍赵华

医药导报 2021年8期

向晓燕，余忠姝，谢佳希，施宇涛，张景勍，赵华

(1.重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心，重庆 400016；2.重庆市巴南区人民医院药剂科，重庆 401320)

吴茱萸碱(evodiamine，ED)是分离自吴茱萸的一种主要活性生物碱。研究报道ED能与多靶点相互作用，发挥广泛的生物活性，如胃肠道调节、心血管保护等，还能通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制迁移和侵袭等多种机制发挥抗肿瘤疗效，是一种有前景的天然药物[1]。但是ED的水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低等缺陷阻碍了其临床应用[2]。目前文献报道的ED制剂包括复合物[3]、脂质体[4]、纳米乳[2]等，这些剂型分别存在改善口服生物利用度效果不明显、安全性不高等不足，不能很好地满足需求。因此高效、安全的ED新剂型的研究和开发具有重要意义。

磷脂和环糊精是安全有效的辅料，用于提高药物溶解度和透膜能力，两者同时与药物络合形成三元体系，显著改善药物的溶解性、增强药物口服吸收[5]。生物相容的天然多糖壳聚糖和透明质酸是低毒、可降解的载体材料，壳聚糖阳离子可与带负电荷的肠黏膜相互作用，打开细胞间隙，促进ED吸收[6]；亲水性透明质酸增加药物溶解、延长其血液循环，也通过主动靶向肿瘤细胞CD44受体，改善药物在肿瘤部位的积累[7]。壳聚糖和透明质酸通过正负电荷相互吸引制备聚电解质纳米粒，用于改善药物体内代谢和分布特征[8]。本研究首先将ED与磷脂、羟丙基-β-环糊精制成三元复合物，辅以富勒醇包载，随后将含药复合物包纳进壳聚糖/透明质酸载体外层中，制备了壳聚糖杂化吴茱萸碱复合纳米粒(chitosan hybrid evodiamine composite nanoparticles，CENP)，希望结合药物复合技术和纳米技术的优势，以达到显著增加ED水溶性、提高ED的口服生物利用度的效果。通过考察CENP和ED在大鼠体内的药动学特征，为ED后续抗肿瘤研究提供方向，并奠定其临床应用的基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 ED(含量>99%，武汉远城科技发展有限公司)；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(含量99.8%，淄博千汇生物科技有限公司)；磷脂(PC)(Lipoid S 100，Phospholipid Gmbh，Nattermannllee，Germany)；壳聚糖(CS)(浙江金壳生物化学有限公司)；透明质酸(HA)(曲阜市广龙生物制品厂)；CENP(实验室自制)；和厚朴酚(西安小草植物科技有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.1.2仪器岛津LC-20A型液相色谱仪(日本岛津公司)；旋转蒸发器(型号：RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(感量：0.1 mg，型号：FA1004A，上海精天电子仪器有限公司)；TGL-16B台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；Zetasizer Nano zs90激光粒度电位仪(日本岛津公司)。

1.1.3实验动物清洁级SD大鼠，雄性，体质量(230±20) g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(渝)2017-0001。饲养环境：温度(20±2) ℃、相对湿度(60±10)%、明暗交替12 h/12 h。

1.2方法

1.2.1CENP的制备及表征采用离子凝胶法制备CENP[9]。称取处方量ED、羟丙基-β-环糊精、磷脂溶于乙醇中，水浴中磁力搅拌3.5 h，40 ℃旋转蒸发除去无水乙醇得淡黄色复合物。取适量复合物，将处方量的透明质酸溶液、富勒醇溶液逐滴、缓慢加入壳聚糖溶液，磁力搅拌30 min得CENP。取适量CENP，用超纯水稀释10倍，采用马尔文激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位。

1.2.2给药方案及样品采集 12只SD大鼠采用随机数字表法分为游离药ED组和制剂CENP组(n=6)，禁食12 h后，分别灌胃相应药物(剂量均以ED 100 mg·kg-1计)。分别于给药后5，10，15，30，45 min、1，2，4，6，8，12，24，48，72，96 h采集血样体积500 μL，随后6000 r·min-1，离心10 min，后取上清液，-80 ℃冻存，待下一步处理。

1.2.3血浆样品的处理取待测血浆样品100 μL，加入1 μg·mL-1内标和厚朴酚溶液20 μL和乙腈500 μL，3000 r·min-1涡旋1 min，静置30 s后重复涡旋1次。将样品离心(12 000 r·min-1，10 min)取上清液，氮气吹干，随后加入乙腈100 μL复溶，涡旋30 s，8000 r·min-1，离心5 min，取上清液40 μL进样。

1.2.4色谱条件色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：10 mmol·L-1乙酸铵：乙腈=40：60；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：225 nm；进样体积：40 μL。

1.2.5方法学考察按照“2.4项”下的色谱条件，通过专属性、线性关系、精密度、回收率和稳定性等试验，考察ED体内含量测定方法的合理性[10]。

1.2.6数据处理以血药浓度为纵坐标、时间为横坐标绘制血药浓度-时间曲线。使用DAS2.1.1 版软件处理数据，计算并比较CENP和ED的主要药动学参数，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.7生物等效性评价采用DAS软件将AUC(0-∞)和Cmax经对数转换后进行方差分析、单双侧t检验和[1-2α]90%置信区间考察；利用非参数统计Wilcoxon秩和检验考察CENP和ED的tmax，比较CENP和ED的生物等效性。

2 结果

2.1CENP的粒径和Zeta电位 CENP的粒径和Zeta电位分别为(423.90±26.12) nm和(43.47±1.20) mV。

2.2CENP的药动学参数 CENP和ED灌胃大鼠后的体内药时曲线图见图1。结果显示，CENP的整体血药浓度水平较ED增加，CENP的Cmax约为ED的3倍，表明CENP增加了ED的口服吸收。CENP的血药浓度达峰时间较ED延迟。当ED在给药后24 h浓度已接近于0时，CENP仍保持较高浓度值，说明CENP延长了药物的体内滞留时间，能发挥更长时间的作用。

图1 大鼠口服CENP和ED后的平均血药浓度-时间曲线

CENP和ED的主要药代参数结果分别见表1和表2。分析非房室模型参数可知，与ED比较，CENP的AUC(0-∞)和Cmax分别增加了约3.57倍和1.92倍。MRT(0-96 h)增加了约7.59 h，CL降低了78.57%，分析房室模型参数可知，CENP的AUC(0-∞)和Cmax分别约为ED的4.18倍和2.92倍。与ED比较，CENP的相对生物利用度AUC(0-∞)在非房室模型和房室模型中分别为457.46%和417.80%，两种模型分析结果相差不大。

2.3生物等效性评价 CENP和ED的药代动力学参数及生物等效性结果，见表3。由表可知，AUC(0-∞)和Cmax的[1-2α]90%置信区间分别为(79.9，82.8)%和(78.3，84.6)%，均不在标准范围内；两者的tmax差异有统计学意义(P=0.01)。综上所述，CENP和ED生物不等效。

3 讨论

本实验成功制备壳聚糖杂化吴茱萸碱复合纳米粒CENP，研究其在大鼠体内的药代动力学特征。CENP的粒径为(423.90±26.12) nm，属于纳米范围。CENP的Zeta电位为(43.47±1.20) mV，> 30 mV，粒子间的反作用力可以避免絮结和凝集，从而保持CENP的稳定性[11]。ED的体内含量测定方法符合要求。药动学结果表明，CENP可以明显改善ED的体内药动学行为，促进ED的口服吸收，减缓药物的清除，延长ED的体内作用时间，增加ED的AUC约3.57倍。CENP增加ED的口服生物利用度的原因可能是：ED与磷脂、环糊精形成三元复合体系，环糊精包纳ED的同时，磷脂也部分伸入环糊精空腔，改善ED的水溶性、稳定性和生物膜透过能力，进而促进ED的口服吸收[5]；纳米载体壳聚糖和透明质酸进一步提高ED的溶解性和胃肠道吸收，改善药物释放行为，同时延长ED的体内循环，减缓清除[12]。与文献[3，13]报道的磷脂复合物、环糊精包合物比较较，CENP改善ED的AUC能力更强。此外，虽然已报道的ED纳米乳分别提高了ED的AUC约3.66和5.30倍[2，14]，略强于CENP提高AUC的能力。但是由于纳米乳的形成需要大量的表面活性剂(如泊洛沙姆188、聚山梨酯80、RH40等)，而这些非离子型表面活性剂可能导致溶血、过敏、神经毒性等不良反应，使纳米乳的临床应用受到了限制[15]。反之，CENP的载体材料具有生物相容性、可降解性和低免疫原性，递送系统安全性更高，具有应用潜力。CENP具有安全有效的特性，它是递送抗癌药物的有前景的平台，具有通过以下多种机制发挥抗肿瘤作用的潜力：CENP具有EPR效应[16]；环糊精能抑制P糖蛋白(P-gp)改善药物吸收并减轻耐药[17]；透明质酸具有控释和主动靶向肿瘤的作用[7]；富勒醇具有自由基清除能力，还可以通过调控肿瘤微环境、抑制血管生成等作用增强药物抗肿瘤疗效[18]。综上所述，本实验首次制备的复合纳米粒CENP是可改善ED药动学行为的新制剂，为提高ED生物利用度的剂型研究提供了一定的参考依据，同时也为后续体内外研究及临床应用奠定基础。