红景天苷对人肺腺癌PC9细胞的上皮-间质转化作用*

张鹏，孙婉瑾，李嫚，徐玉婷

(1.湖北省中医院药事部，武汉 430074；2.湖北省肿瘤医院中西医结合科，武汉 430079)

肺癌仍是目前死亡率最高的恶性肿瘤之一。许多肺癌患者在就诊时已发生转移，多数肺癌患者死亡是由癌细胞转移引起[1]，最近研究[2-3]表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用。EMT是指上皮细胞失去其上皮特征，获得间质特性的过程，它不仅参与胚胎形态的形成、心脏的发育和慢性退行性纤维化，而且促进肿瘤侵袭转移[4-5]。

红景天苷(Salidroside)的化学名为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，其苷元为对羟基苯乙醇，即酪醇。红景天苷具有广泛的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、免疫调节，促进骨骼肌生长、抗氧化、增体质、抗疲劳、抗肌萎缩，保护肝脏、神经、肺、呼吸道、心脏以及降血糖、调血脂、抗肥胖等作用。WANG等[6]证实了红景天苷对肺癌A549细胞的抑制作用是抑制了胞内氧化应激反应与磷酸化p38的表达。但红景天苷对肺癌细胞的研究鲜有报道。本研究以非小细胞肺癌PC9细胞为研究对象，以一定浓度的转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)处理后，给予不同浓度红景天苷处理，观察其对肺腺癌PC9细胞EMT的影响。

1 材料与方法

1.1材料及试剂 人肺腺癌PC9细胞为上海肺科医院肺癌免疫研究室常规传代培养；小鼠抗人上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、神经型钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)、β-连环蛋白(β-catenin，美国Abcam公司，批号分别为Ab76055，Ab18203，Ab8978，Ab7817，Ab32572)。羊抗小鼠IgG(武汉Bioswamp公司，批号：PAB150009)；DMEM(美国Hyclone公司，批号：SH30022.01B)；TGF-β1(美国Peprotech公司，批号：100-21)；纤维连接蛋白(FN)(北京Solarbio公司，批号：F8180)；红景天苷(北京Solarbio公司，批号：SS8080，纯度HPLC≥98%)。红景天苷用DMSO溶解后，作用于细胞的浓度现配(1，5，10 和20 μg·mL-1)。

1.2仪器 酶标仪(美国Thermo公司，型号：Multiskan FC)，恒温培养箱(美国Thermo公司，型号：311)，显微镜(日本Nikon公司，型号：TS100-F)，流式细胞仪(美国Beckman公司，型号：FC500 MCL)。

1.3细胞培养 肺腺癌PC9细胞在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下用含10%新生牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1庆大霉素、低糖-DMEM培养基中培养。用0.25%胰酶消化传代。细胞培养至融合70%～80%后，用无血清培养基饥饿过夜，再加入TGFβ1诱导细胞上皮间质转化处理48 h，按实验要求分为6组：对照组，TGF-β1刺激组，刺激+红景天苷组1 μg·mL-1(sali 1 μg·mL-1组)，刺激+红景天苷组5 μg·mL-1(sali 5 μg·mL-1组)，刺激+红景天苷组10 μg·mL-1(sali 10 μg·mL-1组)，刺激+红景天苷组20 μg·mL-1(sali 20 μg·mL-1组)，肺腺癌PC9细胞在5 ng·mL-1的TGF-β1刺激30 min后，再给予红景天苷干预，分别在干预后24，48，72 h后进行MTT检测，在各时间段显微镜下观察细胞形态，并摄像记录。

1.4MTT绘制生长曲线 取对数生长期的细胞，接种于96孔板，每孔细胞密度约1.0×104个，放入CO2培养箱中培养24 h。每孔内加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，培养箱内孵育4 h，弃去每孔的液体，并以每孔150 μL的计量加入二甲亚砜，震荡5～10 min，使甲臜颗粒充分溶解。使用酶标仪检测490 nm及570 nm的吸光度(A)值，以时间为横坐标，A值为纵坐标绘制生长曲线。

1.5流式检测细胞凋亡 取对数生长期的人肺腺癌PC9细胞，制成单细胞悬液，按每孔1.0×104个，将细胞均匀的接种到6孔板中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养过夜；用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1000 r·min-1，离心5 min，去上清液，PBS重悬润洗2次；1000 r·min-1，离心5 min，去上清液，PBS重悬细胞100 μL，缓慢加入预冷的80%乙醇700 μL，使乙醇终浓度为70% 4 ℃固定4 h以上，1000 r·min-1，离心5 min，预冷PBS润洗2次，加入100 μL RNase(50 μg·mL-1)，37 ℃水浴30 min加入PI(50 μg·mL-1)400 μL，4 ℃避光染色30 min流式细胞仪检测。

1.6Western blotting 分析 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞，每5 min振荡1次，裂解 20 min，4 ℃下15 000 r·min-1，离心30 min，吸取上清液获取总蛋白。根据BCA蛋白定量结果上样，10% SDS-PAGE凝胶电泳2.5 h，转膜后NC膜TBS稍荡洗，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃下分别孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA、β-Catenin一抗过夜，TBST洗10 min×3次，室温孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重复3次，曝光显影；采用 BIO-RAD Image Lab 版统计软件进行灰度值分析。

1.7统计学方法 使用SPSS17.0版统计软件处理数据，计量组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞生长曲线 与Con组比较，TGF-β1组细胞增殖能力显著上升(t=207.277，P<0.05)。与TGF-β1组比较，sali 1 μg·mL-1、sali 5 μg·mL-1组、sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的细胞增殖力均显著降低(F=1665.398，P<0.05)。见图1。

图1 细胞生长曲线

2.2细胞凋亡 与Con组[(4.58±0.27)%]比较，与TGF-β1组[(6.21±1.61)%]的凋亡率上升，但差异无统计学意义(t=1.741，P>0.05)。与TGF-β1组比较，sali 1 μg·mL-1组[(7.33±1.11)%]凋亡率差异无统计学意义(t=0.987，P>0.05)；sali 5 μg·mL-1组[(13.71±1.66)%]，sali 10 μg·mL-1组[(26.15±0.83)%]和sali 20 μg·mL-1组[(28.33±1.11)%]的细胞凋亡率均显著升高(F=180.969，P<0.05)，且在一定范围内，凋亡率随着药物剂量的增加而增加。sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组细胞凋亡率均显著高于sali 5 μg·mL-1组和sali 1 μg·mL-1组。见图2。

2.3细胞形态观察 Con组细胞形态多成椭圆形或者圆形，而经过TGF-β1处理后，大部分细胞形态都明显拉长，细胞呈梭形，相邻细胞间连接也变得疏松。sali 1 μg·mL-1组的细胞形态和TGF-β1组形态相似，而sali 5 μg·mL-1组，sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的细胞形态均多半呈椭圆形，细胞之间连接紧密。见图3。

2.4相关标记蛋白的表达 与Con组比较，TGF-β1组的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表达显著上升(t=66.452，403.664，161.580，136.670，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表达显著降低(t=261.827，154.260，P<0.05)。与TGF-β1组比较，sali 1 μg·mL-1组、sali 5 μg·mL-1组、sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表达均显著降低(F=53 988.214，82 179.748，33 362.584，64 734.791，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表达显著升高(F=54 726.455，63 095.118，P<0.05)。见图4和表1。

图2 6组细胞凋亡率

图3 6组细胞形态

3 讨论

肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤发展的重要步骤，是导致恶性肿瘤患者死亡率高的重要原因[7]。因此，为了控制恶性肿瘤的转移，研究肿瘤转移的机制和特点十分有必要。肿瘤转移是复杂的过程，首先肿瘤细胞脱离原发病灶，通过血管生成和基底膜重建进入循环系统，经淋巴管、血管，抵达靶器官，形成转移肿瘤[8-9]。进入循环系统的肿瘤细胞要到达靶器官要克服循环系统的种种障碍，而EMT能令上皮细胞表型和表面抗原均发生改变，增强细胞的迁徙能力，促进肿瘤细胞的转移[10]。上皮细胞之间连接紧密，游离面和基底面均有显著极性，且高度有序，形态相对稳定一致[11-12]；EMT的发生使细胞间紧密的连接被打破，失去了原有的有序性，稳定性和极性，呈现出形态各异，排列松散的间质细胞特性。本研究首先探讨了红景天苷对肺腺癌PC9细胞增殖和凋亡影响，发现sali 5 μg·mL-1组，sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的细胞增殖力下降且凋亡率显著升高，表明红景天苷可以抑制肺腺癌PC9细胞的增殖并促进凋亡；进一步，笔者通过细胞形态观察发现，Con组细胞形态多成椭圆形或者圆形，经过TGF-β1处理后，相邻细胞间连接也变得疏松。而经过红景天苷处理的细胞形态多半呈椭圆形，细胞之间连接较紧密，提示红景天苷减少肺腺癌PC9细胞EMT的发生。

1.Con组；2.TGF-β1组；3.sali 1 μg·mL-1组，4.sali 5 μg·mL-1组，5.sali 10 μg·mL-1组，6.sali 20 μg·mL-1组。

表1 6组相关标记蛋白的相对表达量

在肿瘤恶性程度进展的过程中上皮细胞表面标记蛋白E-cadherin下调，表明肿瘤细胞的粘附能力下降，运动和浸润能力增强[13-15]，而在神经系统和间质细胞中表达的N-cadherin上调[16]。Vimentin和α-SMA是间质样细胞的标志性分子，通常在上皮细胞中不表达。具有高侵袭性的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞则通常伴有Vimentin和α-SMA的高表达，而将细胞中Vimentin或α-SMA沉默之后，细胞明显减弱甚至失去侵袭迁移能力[17-18]。在本研究中，sali 5 μg·mL-1组，sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的Vimentin和α-SMA的表达均显著降低，而E-cadherin的表达显著升高，N-cadherin显著降低，提示TGF-β1组的细胞发生上皮细胞向间质细胞的转化，经不同浓度红景天苷处理后，sali 5 μg·mL-1组，sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的Vimentin，FN，α-SMA表达下调，提示细胞的EMT减弱，红景天苷能明显减少肺腺癌PC9细胞EMT的发生，预防肿瘤细胞的迁移和侵袭，与形态学观察的结果一致。

β-catenin蛋白肽链中部arm区域，可以和E-cadherin、上皮生长因子受体(EGFR)等蛋白结合而发挥多种功能[19]。β-catenin对细胞的转移和EMT有关键的调控作用，同时也是Wnt信号通路中的关键蛋白[20]，其在细胞质中的浓度直接影响着Wnt信号通路。在正常的上皮细胞中，细胞核内β-catenin含量较少，大量的外源性转录因子并不能引发细胞的EMT现象，而在肿瘤细胞中，由于β-catenin的调控系统障碍使β-catenin在核内聚集，外源性的转录因子可以诱导细胞发生的EMT改变。另一方面，β-catenin和E-钙黏素胞内区相连，形成β-catenin/E-cadherin复合体，该复合体在维持上皮极性，稳定性和完整性中发挥重要作用[21]。本研究中sali 20 μg·mL-1组β-catenin表达显著升高，说明红景天苷通过上调β-catenin抑制细胞中EMT的发生。

综上所述，TGF-β1可诱导肺癌细胞上皮细胞向间质细胞转变，红景天苷可能通过上调β-catenin抑制肺癌细胞中EMT的发生，减少间质细胞的数量，延缓肿瘤细胞的迁移。