lncRNA RPA3-AS1/miR-203a-3p/BAG3分子轴对人心肌细胞凋亡的影响*

黄 锐，王 剑△，谭 慧，周利平，杨化冰，刘 娟

1.利川市人民医院心血管内科，湖北利川 445400;2.恩施州中心医院西医部药剂科，湖北恩施 445000

急性心血管事件是人类死亡的主要原因之一，伴随人口老龄化的加重，心血管疾病的发生率逐年增加[1-3]。心肌缺血再灌注可加重心肌细胞甚至心脏结构的损伤，严重影响心脏功能[4-6]。心肌细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的重要原因[7-8]。因此，降低心肌细胞凋亡率是预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的关键。长链非编码RNA(lncRNA)是一种高度保守的单链内源性RNA，长度超过200个核苷酸[9-10]。lncRNA广泛参与调控基因的表达，在细胞的发育、增殖、衰老、凋亡等进程中发挥关键作用[11-12]。越来越多的研究发现，心肌细胞损伤伴随lncRNA表达谱的改变，lncRNA表达增加或降低可导致心律失常、心肌肥大、心肌梗死等各种心脏疾病[13]。全血lncRNA的表达水平是诊断心血管疾病的重要标志物[14]。RPA3-AS1是近年来新发现的lncRNA，RPA3-AS1在人类疾病特别是心血管疾病的关系尚不明确。本研究旨在探讨RPA3-AS1是否在心肌缺血再灌注损伤中发挥作用，探究RPA3-AS1在心肌细胞中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本 收集2019年1月至2020年6月利川市人民医院心血管内科治疗的43例急性心肌缺血患者(患者组)全血标本，以及同期43例体检健康者(健康组)全血标本。本研究得到利川市人民医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.1.2细胞与试剂 人心肌细胞系AC16购于中科院上海细胞库。高糖DMEM培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司。实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒和转染试剂LipofectamineTM3000购于美国Invitrogen公司。噻唑蓝(MTT)试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。TRizol裂解液购于美国Sigma公司。载有RPA3-AS1序列的质粒和阴性对照质粒购于上海和元生物技术股份公司。一抗和二抗购于美国Abcam公司。Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 于37 ℃、5% CO2的培养箱中，人心肌细胞系AC16培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基中。将对数生长期AC16细胞接种于6孔板，待细胞密度达到60%时，根据LipofectamineTM3000转染试剂说明书，转染载有RPA3-AS1序列的质粒(实验组)和阴性对照质粒(对照组)，培养箱中继续培养48 h。

1.2.2qPCR检测 RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表达 采用TRIzol-氯仿-异丙醇体系提取全血标本和细胞系总RNA，逆转录合成cDNA。qPCR反应条件为95 ℃ 6 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，总共40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA相对表达量。以GAPDH为内参检测RPA3-AS1和BAG3 mRNA的表达；以U6为内参检测miR-203a-3p的表达。引物序列如下，miR-203a-3p正向引物：CCG GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA G，反向引物：GCC GCG TGA AAT GTT TAG G；GAPDH正向引物：CTG GGC TAC ACT GAG CAC C，反向引物：AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG；BAG3正向引物：AGC TCC GAC CAG GCT ACA TT，反向引物：GGA TAG ACA TGG AAA GGG TGC。U6正向引物：CTC GCT TCG GCA GCA CA，反向引物：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT。

1.2.3MTT法检测AC16细胞活力 将对数生长期的两组细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，每孔加入200 μL培养基。分别在接种后第1、2、3、4、5 d两组的细胞活性。MTT检测时，在各孔细胞中加入20 μL MTT试剂(浓度为5 g/L)，在培养箱中培养4 h后吸去液体，各孔加入150 μL二甲基亚砜，室温下在震荡摇床振荡至结晶完全溶解，酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度(A)值(反映细胞活力)。

1.2.4流式细胞术检测AC16细胞凋亡率 收集对数生长期的两组细胞，采用PBS溶液洗3次，采用binding buffer重悬细胞并调整细胞密度。分别取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC并混匀，加入5 μL PI并混匀，在培养箱内避光培养15 min。加入100 μL binding buffer并混匀，在1 h内采用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。

1.2.5生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制 采用生物信息学软件starBase v2.0预测RPA3-AS1可配对结合的miRNA。采用生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测miR-203a-3p可配对结合的靶基因mRNA。

1.2.6Western blot法检测BAG3蛋白和相关凋亡蛋白的表达 采用细胞裂解液提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，每组取35 μg总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳。硝酸纤维素膜转膜后，采用5%脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗在4 ℃下孵育过夜。洗膜后，加入二抗在室温下孵育2 h。滴加ECL发光液，在成像系统中采集图像。

2 结 果

2.1两组受试者全血中RPA3-AS1的表达 健康组和患者组全血中RPA3-AS1的相对表达水平分别为6.19±0.57和1.35±0.41，与健康组相比，患者组全血RPA3-AS1的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：与健康组相比，aP<0.01。

2.2两组AC16细胞中RPA3-AS1的表达 健康组和患者组AC16细胞中RPA3-AS1相对表达水平分别为1.01±0.07和9.91±1.27，患者组RPA3-AS1相对表达水平显著高于健康组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3高表达RPA3-AS1抑制AC16细胞活力 MTT法结果显示，从第2 天起，患者组AC16细胞活力显著高于健康组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与健康组相比，bP<0.05，aP<0.01。

2.4高表达RPA3-AS1抑制AC16细胞凋亡 流式细胞术显示，转染质粒48 h后，患者组和健康组AC16细胞凋亡率分别为(3.93±0.62)%和(10.76±1.48)%，与健康组相比，高表达RPA3-AS1显著抑制AC16细胞的凋亡，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。

注：与健康组相比，aP<0.01。

2.5生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制 采用生物信息学软件starBase v2.0预测RPA3-AS1可配对结合miR-203a-3p。采用生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测miR-203a-3p可配对结合BAG3 mRNA。见图4。

图4 生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制

2.6高表达RPA3-AS1的AC16细胞中miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表达 qPCR结果显示，患者组和健康组AC16细胞miR-203a-3p的相对表达水平分别为0.26±0.04和1.03±0.14，高表达RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表达(P<0.01)。患者组和健康组AC16细胞BAG3mRNA的相对表达水平分别为4.59±0.56和1.03±0.08，miR-203a-3p表达水平降低后，BAG3 mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.7高表达RPA3-AS1促进BAG3蛋白表达 Western blot结果显示，高表达RPA3-AS1的AC16细胞中，BAG3蛋白表达水平明显升高，BAG3蛋白表达水平升高后，细胞中Bcl-2和p53蛋白表达水平升高，Bax和Caspase-8蛋白表达水平降低。见图5。

图5 Western blot法检测BAG3蛋白及相关凋亡蛋白表达情况。

3 讨 论

lncRNA是一种内源性的非编码RNA，参与调控基因的转录和翻译，影响细胞的各种生命进程[15-16]。越来越多的lncRNA如H19、AK139328、TUG1、KCNQ1OT1、MALAT1等被证实与心血管疾病的发生、发展密切相关，在心肌缺血再灌注损伤中发挥关键调控作用[17-20]。RPA3-AS1是近年来新发现的lncRNA，其作用机制尚未见报道。本研究中，通过检测健康组和患者组全血标本发现，RPA3-AS1在患者组全血标本中的表达明显低于健康组，表明其可能在心肌缺血中发挥重要作用，可能与心肌缺血再灌注损伤相关。临床研究表明，心肌细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发生的主要因素[21-22]。本研究结果表明，心肌细胞高表达RPA3-AS1后，心肌细胞的活力显著增加，心肌细胞的凋亡率显著降低，RPA3-AS1可增强心肌细胞活力并抑制其凋亡。

近年来研究发现，lncRNA主要通过以不完全互补配对的方式与微小RNA(miRNA)结合，抑制miRNA与靶基因mRNA的配对结合，在转录后水平促进miRNA靶基因的表达[23]。本研究通过生物信息学软件starBase v2.0预测，RPA3-AS1可配对结合miR-203a-3p。miR-203a-3p可促进脂多糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症，沉默miR-203a-3p可下调心肌细胞凋亡蛋白的表达，降低心肌细胞的凋亡率[24]。本研究结果表明，高表达RPA3-AS1后，人心肌细胞中miR-203a-3p表达水平降低，RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表达。本研究通过生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测，miR-203a-3p可配对结合Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(BAG3)mRNA。BAG3蛋白是一种高度保守的热休克蛋白70(HSP70)分子结合伴侣，属于抗凋亡基因(BAG)家族蛋白，可在多个水平调控细胞的活性、凋亡、转移等生理过程[25]。BAG3蛋白可抑制心肌细胞的凋亡，BAG3蛋白表达缺失与缺血再灌注心肌损伤密切相关[26]。本研究结果表明，miR-203a-3p表达降低后，人心肌细胞中BAG3基因表达显著升高，表明miR-203a-3p可能发挥抑制BAG3基因表达的作用。Bcl-2和p53蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，Bax和Caspase-8蛋白具有促进细胞凋亡的作用，因此，Bcl-2、p53、Bax和Caspase-8蛋白表达水平可反映细胞凋亡情况。本研究发现，高表达RPA3-AS1后，人心肌细胞中Bcl-2和p53蛋白表达升高，Bax和Caspase-8蛋白表达降低，提示RPA3-AS1可抑制心肌细胞的凋亡，从而可能预防和治疗心肌缺血再灌注损伤。本课题组下一步将通过双荧光素酶报告基因实验证实RPA3-AS1与miR-203a-3p及miR-203a-3p与BAG3 mRNA之间的配对结合。

lncRNA RPA3-AS1可能通过调控miR-203a-3p/BAG3分子轴促进人心肌细胞的活性并抑制其凋亡。本研究首次揭示RPA3-AS1在人心肌缺血再灌注损伤中的作用及可能的作用机制，为RPA3-AS1的临床应用提供了一定的实验基础。