联合检测AchR-Ab和抗横纹肌抗体对重症肌无力的诊断价值*

韩 波，朱思绮，朱敬轩，张 程

辽宁中医药大学附属医院检验科,辽宁沈阳 116600

重症肌无力(MG)是一种多因素调控的器官特异性自身免疫性疾病，其临床表现为全身或部分骨骼肌无力和易疲劳。流行病学统计提示MG发病率为(0.3～2.8)/100 000，全球约有70万MG患者，而中国年平均发病率为(8.0～20.0)/100 000。MG的女性患病率较男性高，且在各个年龄阶段均可发病。目前，诊断MG在具有临床特征的基础上，尚缺乏快速高效的实验室辅助诊断指标，需要探寻更高灵敏度和(或)特异度的诊断方法，因此，本研究联合检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)和抗横纹肌抗体(AsM-Ab)，评价这两种血清自身抗体联合检测对MG的诊断价值，为临床提供诊断客观依据，以便进一步展开治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2018年11月至2019年12月初步诊断为MG的患者150例为MG组，其中男55例、女95例，平均年龄(45.65±15.72)岁，眼肌型30例、全身型66例、重度激进型28例、迟发重度型17例、肌萎缩型9例[1]；选择同期在本院门诊和住院的除患有MG之外的其他自身免疫病患者70例为其他自身免疫病组(OAD组)，其中男24例、女46例，平均年龄(41.37±12.66)岁；选取同期体检健康者80例为健康对照组，其中男28例、女52例，平均年龄(42.16±11.44)岁。各组的年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.1.1MG的西医诊断标准[2](1)临床表现：某些特定的横纹肌无力，晨轻暮重；(2)药理学表现：新斯的明试验阳性；(3)重复神经刺激(RNS)检查波幅递减10.00%以上；(4)在多数全身型MG患者血中可检测到AchR-Ab。在具备典型MG临床特征的基础上，同时具备药理学特征和(或)神经电生理学特征，临床上则可诊断为MG。有条件的单位可检测患者血中的AchR-Ab等有助于进一步明确诊断。需要排除发病前3个月内曾使用激素或免疫抑制剂者，伴有其他自身免疫性疾病、其他肌肉疾病或合并心、肺、肝、肾等器官功能疾病及妊娠或哺乳期妇女。

1.1.2MG的临床分型 改良的Osserman分型[2]Ⅰ型：眼肌型；Ⅱ型：全身型，ⅡA型(轻度全身型),ⅡB型(中度全身型)；Ⅲ型：重度激进型；Ⅳ型：迟发重度型；Ⅴ型：肌萎缩型。

1.2仪器与试剂 抗核抗体谱(IgG)的检测采用IgG检测试剂盒(印迹法)[来自欧蒙公司(批号为CD200721AA)]、IgG检测试剂盒(间接免疫荧光法)[来自欧蒙公司(批号为CF200527AC)]、AchR-Ab酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒[来自英国RSR公司(批号为KAE88A)]、欧蒙荧光显微镜EUROStar、酶标仪BIO-RAD(Model 680)。

1.3方法 所有研究对象均空腹采集当日或入院后次日肘正中静脉血3～5 mL经3 000 r/min离心10 min后，取上清液，保存于-20 ℃冰箱待测。

1.3.1ELISA检测AchR-Ab (1)分别取待检血清、阳性对照、阴性对照及校准血清100 μL装入1.5 mL的Eppendorf管中，并做好相应标记。(2)加入25 μL胎儿型和成人型AchR混合物并密封试管，确保所有液体都在试管底部(可15 000 r/min离心10 s)，振荡混匀，于2～8 ℃孵育16～20 h。(3)将每管样品AchR混合物振荡混匀后，分别取50 μL加入AchR MAb1酶标板中，并留2个孔作为空白对照，在室温下用ELISA平板摇床(500次/min)孵育1 h。(4)将液体吸出，稀释液清洗酶标板3次。(5)将50 μL重组AchR MAb生物素加入每孔中(除空白孔外)，置室温下用ELISA平板摇床(500次/min)孵育1 h。(6)重复步骤(4)。(7)将100 μL抗生蛋白链霉素-过氧化物酶(SA-POD)加入每孔中(除空白孔外)，置室温下用ELISA平板摇床(500次/min)孵育30 min。(8)重复步骤(4)，再用清水洗涤一次后。(9)将100 μL显色物TMB加入每孔中(包括空白孔)，在室温下黑暗中放置30 min。(10)将50 μL终止液加入每孔中，在摇板器上摇动约5 s。(11)在30 min内于450 nm波长处读取每个孔的吸光度，血清抗AchR抗体>0.45 nmol/L即为阳性。

1.3.2间接荧光免疫(IFA)检测AsM-Ab (1)滴加0.01 mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)于已知抗原标本片，10 min后弃去，使标本片保持一定湿度。(2)用PBS缓冲液以1∶100,1∶1 000两个稀释倍数稀释标本。(3)滴加25 μL已稀释的待检抗体标本，37 ℃保温30 min。(4)用PBS冲洗1～2次，于PBS浸泡5 min。(5)用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加25 μL荧光标记的抗人球蛋白抗体，37 ℃保温30 min。(6)重复操作4。(7)用滤纸吸去多余水分，滴加1滴缓冲甘油。(8)荧光显微镜高倍视野下观察。观察标本的特异性荧光强度：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++～++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，即可判定为阳性。(9)根据判定结果决定标本最终的滴度。

阳性结果(荧光模式)，猴髂腰肌：骨骼肌细胞胞质可见典型的横纹荧光见图1。猴心肌：心肌细胞胞质可见典型的横纹荧光见图2。

图1 猴髂腰肌横纹荧光图

图2 猴心肌横纹荧光图

1.4统计学处理 上述数据的统计学分析均采用SPSS23.0软件进行，以临床诊断为金标准，采用四格表分别计算各自身抗体单项及联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。3组抗体阳性率比较及分析抗体与临床表型的关系均采用χ2检验，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1AchR-Ab、AsM-Ab阳性率的比较 MG组的AchR-Ab、AsM-Ab阳性检出率明显高于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 AchR-Ab、AsM-Ab阳性率的比较[n(%)]

2.2单项和联合检测抗体对诊断MG的效能评价 单项指标比较，AchR-Ab诊断MG的灵敏度高于AsM-Ab，差异有统计学意义(P<0.05)；两指标联合检测诊断MG的灵敏度高于单项检测，差异有统计学意义(P<0.05)；联合检测的特异度、阳性预测值和阴性预测值均高于任意一项单项检测，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 单项和联合检测抗体对诊断MG的效能评价(%)

2.3AsM-Ab与改良Osserman分型的关系 MG组的AsM-Ab阳性率Ⅰ型为16.70%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型依次高于Ⅰ型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 AsM-Ab与改良Osserman分型的关系

3 讨 论

MG是一类高发病率的器官特异性自身免疫性疾病，严重影响患者的正常生活和身心健康，给社会和家庭带来了严重的负担。MG患者的临床和病理表现多样，发病机制复杂，且由于MG患者的个体化差异，比如病情严重程度、发病年龄、体内抗体状态、并发症和不良反应等[3]，应给予快速准确的诊断。

MG 的发病机制到目前为止并不十分清楚，其主要病因是患者机体中出现针对神经-肌肉接头(NMJ)突触后膜上成分的自身抗体所致，主要是AchR-Ab。AchR是由4种同源亚基构成的跨膜糖蛋白，属于阳离子通道[4]。人类肌肉有2种类型的AchR，其中胎儿型的亚基组成为 2α、β、δ、γ，成人型中γ亚基被ε亚基所取代[5]。AchR-Ab的主要免疫原区(MIR)在α亚基，其核心部位位于胞外段的第67～76位氨基酸。AchR-Ab大多数为IgG1和IgG3亚型，通过与突触后膜上的AchR结合，可以激活补体级联反应，致使突触后膜受体数目减少[6]，阻断骨骼肌间神经信号传导。超过85.00%的全身型MG患者和大约一半的单纯眼部肌无力患者都有AchR-Ab[7],且其阳性为诊断MG标准之一，故AchR-Ab为诊断该病的必须检测项目。

MG患者的外周血中除了AchR-Ab外，还存在多种以肌肉为靶点的抗体，称为抗肌抗体。有研究表明[8]首先应用免疫荧光技术发现MG患者血清内存在一种与骨骼肌结合的球蛋白因子，有研究[9]表明此种球蛋白因子是IgG，荧光显微镜下它与骨骼肌结合的形式呈横纹状，称之为AsM-Ab，有文献报道其抗体检测阳性率为47.00%，可应用于MG的诊断[10]。有研究表明，间接免疫荧光法(IFA)检测抗肌抗体有助于确诊疑似MG患者，尤其是患者AchR-Ab阴性时，AsM-Ab的检测尤为重要[11]。间接免疫荧光法是以纯化的猴髂腰肌、心肌细胞作为检测MG自身抗体的抗原基质，再以荧光示踪物质标记抗体而进行抗原定位。此方法特异性强、灵敏度高、速度快，与放射免疫(RIPA)相比，其无放射性污染且操作简单。与免疫印迹法相比，其包含所有骨骼肌细胞及心肌细胞的全部细胞结构，筛查范围更广，灵敏度更高。

本研究对150例MG患者、70例其他自身免疫病患者及80例健康对照者的血清标本进行检测，结果显示AchR-Ab和AsM-Ab诊断MG的阳性检出率分别为80.67%和57.33%，均高于OAD组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。AchR-Ab在MG患者中阳性率高的原因[12]为：(1)补体激活造成AchR破坏和突触后膜局灶性溶解，导致神经肌肉接头处终板膜上的AchR和AchR相关蛋白的破坏；(2)封闭乙酰胆碱受体导致其加速内化和降解；(3)AchR 阻断乙酰胆碱结合位点。AsM-Ab在MG患者中阳性率偏高的原因为，在补体参与下，AsM-Ab与其受体发生应答，经由补体介导的细胞膜溶解作用使骨骼肌成分被大量破坏，影响了神经肌肉组织的信号传导及肌纤维的收缩，导致肌无力[12]。说明两种血清自身抗体是诊断MG的标志性抗体，也提示AsM-Ab检测有助于MG和其他自身免疫病的鉴别，且具有较满意的诊断价值，是诊断MG的新型免疫学指标，可在临床推广应用。其中，AchR-Ab的阳性率高于张鹏等[12]的研究，可能与不同的实验方法其灵敏度和特异度不同有关；AsM-Ab的阳性率高于朱慧等[9]的研究，可能与间接免疫荧光效价的判断有关，目前仍采用人工镜检的方式判读结果，且每个实验室的判读标准也不尽相同。

本研究同时分析了AsM-Ab与改良Osserman分型之间的关系，发现MG患者Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型的AsM-Ab阳性率依次高于Ⅰ型，且差异有统计学意义(P<0.05)。有学者研究认为，AsM-Ab存在于高达95.00%的胸腺瘤MG患者和50.00%的晚发型无胸腺瘤MG患者[13]，可初步推测AsM-Ab可能预示病情的严重程度和(或)伴随胸腺瘤的发生，尚待进一步的前瞻性研究。

本研究同时对MG患者的AchR-Ab和AsM-Ab进行单项指标检测，发现AchR-Ab的灵敏度高于AsM-Ab，差异有统计学意义(P<0.05)。由于AsM-Ab的灵敏度(57.30%)较低，单独检测一种自身抗体诊断MG的灵敏度和准确性存在局限性，需将两种抗体联合检测，以提高诊断价值。本研究对AchR-Ab、AsM-Ab两种血清自身抗体联合检测，结果显示联合检测时比任意一项阳性时诊断MG的灵敏度明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其特异度、阳性预测值及阴性预测值也均较单项检测有所提高，因此，联合检测可大幅度降低漏诊率、减少误诊率，具有很高的诊断价值。

综上所述，AchR-Ab和AsM-Ab是诊断MG的标志性抗体，联合检测可提高诊断MG的灵敏度，降低因单项检测出现的漏诊和误诊；同时AsM-Ab可作为判断患者病情严重程度的指标，为临床进一步开展针对性治疗提供重要依据。