免疫检查点抑制剂相关生物标志物的研究及临床应用*

陈彦青，曹 炬

重庆医科大学附属第一医院医学检验科,重庆 400016

随着2011年美国食品及药物管理局(FDA)批准的首个免疫检查点抑制剂(ICIs)Ipilimumab的上市，医学界开启了ICIs用于临床抗肿瘤治疗的新纪元，是肿瘤免疫治疗的革命性里程碑。免疫检查点指免疫细胞在维持免疫耐受过程中为调节和控制免疫应答的持久性而具有的一系列抑制通路[1]。而肿瘤细胞又恰好可以通过激活免疫检查点通路抑制抗肿瘤免疫应答[2]。因此，ICIs主要通过抑制T细胞介导的这种抑制性免疫应答，促进免疫介导的肿瘤细胞清除。目前，ICIs主要分为两类：一类是靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的抗体；另一类是靶向程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配体程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的抗体。尽管ICIs疗法可以为一部分患者提供持久的治疗效果，但一部分患者会发生耐药，还有一部分患者会出现自身免疫样毒性，也就是免疫相关不良事件(irAEs)。耐药可以分为两大类：一类是原发性耐药，患者对ICIs没有任何反应并且肿瘤进展迅速；另一类是获得性耐药，患者最初对ICIs治疗有反应，但最终出现临床和/或放射学上的疾病进展[3]。而irAEs可以发生在皮肤、甲状腺、胃肠道、肝、肺等任何器官，根据恶性肿瘤的类别、ICIs的种类和易感性而存在个体差异[4-9]，严重者会出现肿瘤暴发性进展甚至死亡。ICIs相关生物标志物的研究可以避免上述耐药、不良反应的发生，帮助临床实现个体化精准治疗，选择合适的方法进行治疗，延缓患者疾病的进展，提高患者的疗效，减少不必要的经济负担，早期识别不良反应，避免不良反应的发生，延长患者的生存期。因此，寻找能够判断ICIs疗效、耐药，预测和诊断irAEs的生物标志物亟不可待。

1 ICIs及其相关反应的机制

1.1ICIs的作用机制 CTLA-4通路与PD-1通路有许多相似之处，两者都在活化的T细胞中有表达，均是B7/CD28共刺激受体家族的成员，且均能抑制T细胞增殖、葡萄糖代谢、细胞因子表达和T细胞存活[10]。但两者也有许多不同之处，其反应时间、反应场所、具体表达细胞、配体表达细胞及具体作用机制均有不同，具体如下。

1.1.1CTLA-4类抗体的作用机制 首个被美国FDA批准上市的ICIs Ipilimumab就是靶向CTLA-4的抗体，主要用于黑色素瘤的治疗[11-12]。CTLA-4，又名CD152，仅由T细胞表达。在静止的T细胞中，CTLA-4是一种胞内蛋白，当主要组织相容性复合物(MHCs)与T细胞受体(TCRs)结合，共刺激受体CD28与配体CD80(B7.1)和CD86(B7.2)结合后，CTLA-4转移到细胞表面，竞争性地与共刺激因子CD80/CD86结合，介导抑制性信号进入T细胞，从而阻止T细胞增殖和活化。与CD28相比，CTLA-4与CD80/86配体的亲和力更高[13]。因此，CTLA-4可以在淋巴结免疫应答的早期控制T细胞的增殖和活化。不同于效应T细胞(Teff)，调节性T细胞(Treg)构成性表达CLTA-4[14]，在炎性反应刺激下，抗原提呈细胞(APCs)上调CD80/CD86的表达，减弱Treg表面CTLA-4对CD28的竞争性抑制，从而激活共刺激信号，促进T细胞增殖，增强炎症免疫应答。而在肿瘤微环境(TME)中，CD80/CD86受Treg的控制，大量的Treg抑制免疫应答。而CTLA-4抗体具有比CD80/CD86更高的CTLA-4亲和力，其与CTLA-4结合可使Treg耗竭或功能性阻断。CTLA-4抗体还可以防止APCs跨内吞作用，增加其表面CD80/CD86的表达，并通过表达FcR-Ⅳ肿瘤内巨噬细胞介导的直接Treg毒性和抗体依赖性细胞毒性，增强T细胞活化和抗肿瘤免疫应答[15-16]。

1.1.2PD-1/PD-L1类抗体的作用机制 PD-1在活化的T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞上均有表达，并且是外周组织后期抗肿瘤免疫的重要组成之一[17-18]。PD-1，又名CD274，是B7/CD28共刺激受体家族中的成员，通过与配体PD-L1和PD-L2结合来抑制T细胞活化[19]，维持免疫稳态。PD-L1在多种肿瘤细胞中高表达[20]，并且在TME中，宿主树突状细胞(DC)、巨噬细胞、成纤维细胞及T细胞中也表达PD-L1，从而抑制抗肿瘤免疫[21-22]。此外，PD-L1的表达还受JAK2、STAT等基因转录信号通路[23-24]，转录后和翻译后修饰[25-26]及外泌体转运[27]等的调控。用抗体阻断PD-1受体或其配体PD-L1可重新激活TME中耗竭的免疫细胞并消除癌细胞，增强抗肿瘤免疫活性，还能降低PD-L1驱动的非免疫检查点功能，减弱DNA损伤反应和修复[28-29]。并且，通过抗体下调APC和DC上的PD-L1表达还可以提高对ICIs联合疗法的反应率[30-31]。

1.2ICIs耐药的机制 目前，对ICIs耐药机制的研究依赖于临床前研究和相关的临床数据[32]。而由于缺乏对ICIs长期疗效和临床反应相关的临床、分子、免疫学因素的认识，ICIs治疗相关的原发性和获得性耐药机制也尚未完全阐明。但已经明确的是，ICIs耐药往往与抗原加工和呈递中的体细胞突变，与细胞黏附、血管生成[33]和细胞外基质重塑有关的基因上调[34]，以及一些信号通路的改变有关。其中，原发性耐药的机制包括抗原突变、肿瘤抗原表达缺失[35]、HLA表达缺失、抗原加工机制改变[36]，以及T细胞功能不全。T细胞功能不全包括与MAPK、PTEN/PI3K[37]、WNT/β-catenin[38]和BRAF[39]等致癌基因信号和组成性PD-L1表达[40]改变有关的遗传性T细胞抵抗,与干扰素-γ(IFN-γ)信号通路突变有关的T细胞不敏感，由Treg/Teff比例失调引起的T细胞抑制功能失调和肿瘤特异性TCRs缺乏的T细胞缺乏。而目前对继发性耐药机制的研究还较少，但类似于原发性耐药，其机制同样也包括靶抗原、HLA丧失，干扰素信号改变及T细胞功能丧失。但又不同于原发性耐药患者中β2-微球蛋白(β2-MG)缺失引起的MHCⅠ类抗原提呈缺失，大多数具有β2-MG突变和蛋白表达缺失的患者仍然对ICIs敏感，不表现为继发性耐药，提示虽然原发性耐药和继发性耐药的表型机制相似，但其根本机制有本质区别，有待进一步探索。

1.3irAEs的机制 irAEs的机制尚未完全明确，但可以肯定其机制与其相应药物的治疗机制基本一致。其潜在机制主要包括针对肿瘤和健康组织中抗原的T细胞活性增加，之前存在的自身抗体水平增加以及炎症细胞因子表达上升。有研究发现，在1例患者的心肌和肿瘤组织中有类似的T细胞克隆[41],提示在正常组织中，针对肿瘤的T细胞与针对相关抗原的T细胞之间存在交叉反应[42]，T细胞抗肿瘤活性增加的同时可能也会攻击正常的组织细胞，导致细胞介导的组织损伤。同时，ICIs可能重新激活原本处于休眠状态的自身反应性T细胞，导致T细胞对肿瘤抗原和自身抗原的耐受性下降，自身反应性B细胞活化并最终形成自身抗体，引起irAEs，但目前仍缺乏irAEs患者自身抗体表达差异的前后对照研究。T细胞活化必然会引起炎症因子表达增加，炎症因子的级联放大效应在irAEs的发生、发展中也发挥了重要作用。虽然CTLA-4通路与PD-1/PD-L1通路存在一些相似之处，但其本质不同。因此，其机制也因ICIs种类而各有侧重。CTLA-4抗体侧重于破坏稳态外周的阴性选择，促进了新的自我反应性T细胞的发育，而PD-1主要激活转录因子，改变耗竭T细胞的表观基因，导致其重新激活并增加了攻击自身组织的可能性。并且，CTLA-4抗体可以直接与垂体等正常组织的CTLA-4结合，增强补体介导的细胞毒副作用[43]。特定irAEs可能涉及不同的病理学、生理学机制，需要具体问题具体分析。而遗传学、免疫系统状态，以及如宿主微生物组学、肠道菌群等的其他环境因素在irAEs中的作用仍不清楚，还有待进一步了解。

2 ICIs相关生物标志物

2.1评估ICIs疗效的生物标志物 ICIs疗效与肿瘤基因组学、宿主遗传学，及免疫微环境(IME)有关的PD-L1表达、淋巴细胞表型、炎症因子表达等有关。肿瘤种类不同，免疫检查点的应用不同，ICIs引起的免疫应答也不同。并且ICIs药物史会影响生物标志物的预测效力，但并不会影响药物的疗效。

肿瘤基因组学的生物标志物主要通过基因突变影响T细胞对肿瘤细胞的识别来评估ICIs的疗效。与ICIs疗效呈正相关的潜在肿瘤基因组学相关的生物标志物包括肿瘤突变负荷(TMB)、MHCs特异的亲和力指数(DAI)、错配修复缺陷(MMRd)和插入缺失突变。与ICIs疗效呈负相关的潜在肿瘤基因组学相关的生物标志物包括CTLA-4抗体耐药相关的黑色素瘤相关抗原(CRMA)、肿瘤内的异质性(ITH)和体细胞拷贝数(SCNAs)。另外，有研究表明BRAF[44]、PBRM1[45]缺失突变与PD-1抗体疗效呈正相关关系，KRAS突变合并LKB1缺陷与PD-1疗效呈负相关关系[46]； SERPINB3和SERPINB4突变与CTLA-4抗体疗效呈正相关关系[47-48]。

宿主遗传学相关的生物标志物主要与宿主免疫基因多态性有关，包括HLA-Ⅰ多样性和FcγR单核苷酸多态性，均与ICIs疗效呈正相关关系。HLA-Ⅰ多样性主要表现在HLAB和HLAC位点：HLAB编码的MHCs能够与更多样化的TCRs结合，HLAC在APCs中的表达高于其他细胞。并且，从TMB和TCRs的角度考虑，HLA-Ⅰ 多样性也能促进ICIs疗效提高。研究表明，在黑色素瘤中，等位基因CD16AV158F编码的FcγR与IgG免疫球蛋白的亲和力增加，与CTLA抗体疗效呈正相关关系[49]。

与IME有关的生物标志物包括免疫细胞、细胞因子及PD-L1。免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、CD8+T细胞、CD4+记忆T细胞和骨髓源性抑制细胞(MDSCs)。细胞因子主要是TGF-β，其可以促进CD8+T细胞排斥。而PD-L1作为PD-1/PD-L1抗体的作用靶点，和TMB都是ICIs治疗的独立预测因子。其中，与ICIs疗效呈正相关的是TILs、CD8+T细胞、CD4+记忆T细胞和PD-L1。其余与ICIs疗效呈负相关关系。

此外，还有一些全身性的生物标志物也与ICIs疗效有关，如淋巴细胞计数、单核细胞计数、Treg水平、嗜酸性粒细胞计数、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10表达及乳酸脱氢酶活性等。值得注意的是，MMRd实际上会表现出微卫星不稳定性(MSI)，MSI阳性肿瘤实质是一种特殊的高TMB肿瘤，其会高表达PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3及IDO1。因此，除PD-L1之外，PD-1、CTLA-4、LAG3及IDO1也可能成为与ICIs治疗的潜在生物标志物。

2.2ICIs耐药的生物标志物 由于缺乏MHC Ⅰ类分子，抗原加工和提呈受干扰，上文提到的CRMA，也是CTLA-4抗体治疗耐药的生物标志物。而SCNAs会干扰肿瘤抗原与MHCs的装配，也是耐药的生物标志物之一。另外，PTEN失活[37]、IFN-γ信号通路相关的基因突变，以及WNT/β-catenin信号通路也是ICIs耐药的生物标志物[38]。

2.3预测和诊断irAEs的生物标志物 目前，普遍认为女性、身体机能状态较差及少肌性肥胖均是irAEs的危险因素。而irAEs诊断主要通过排除其他感染、药物等原因，依赖常规的实验室指标、影像学表征及病理学分析确定的终末器官功能障碍。若诊断不足可能会导致不适当的毒性治疗的持续及不良反应的加剧；相反，若过度诊断则可能导致不适当的ICIs使用的永久保留或终止，以及不适当的糖皮质激素或其他免疫抑制剂的使用。因此，急需一些生物标志物来早预测、早预防、早诊断、早治疗irAEs。

预测和诊断irAEs的潜在生物标志物可分为细胞、内分泌激素、自身免疫抗体、细胞因子及趋化因子、微生物、遗传及影像学指标几大类。细胞类包括上文提到的Treg，低基础Treg水平可能增加ICIs引起的结肠炎发生的风险，而CD4+T细胞则恰恰相反，高基础水平反而会增加ICIs引起的结肠炎发生的风险，但两者对于预测irAEs均缺乏特异度，无法将其与预测ICIs疗效区分开。还有淋巴细胞计数、中性粒细胞与淋巴细胞比值、嗜酸性粒细胞计数、T细胞多样性和CD8+T细胞均与irAEs的发生、发展呈正相关关系。前3者虽然便宜、常用，但缺乏灵敏度和特异度；后两者价格昂贵，且对于irAEs患者个体的提示意义尚不明确，可用性有限。内分泌激素中唯一能预测和诊断irAEs的促甲状腺激素(TSH)和自身免疫抗体中的抗甲状腺球蛋白是与ICIs引起的甲状腺炎呈正相关的生物标志物，且具有特异度。其他的自身免疫抗体类生物标志物还包括GAD65抗体、胰岛素抗原-2抗体、锌转运体8抗体、胰岛素抗体和抗核抗体，前4者是诊断ICIs引起的糖尿病的生物标志物，价格昂贵，可用度有限；后者与irAEs发展有关，但对irAEs患者个体缺乏特异度。

能够预测和诊断irAEs的细胞因子和趋化因子类的生物标志物有很多，可以独立应用作为irAEs生物标志物的包括IFN-γ、IL-6、IL-17、瘦素、可溶性CD163和CRP。治疗后的IFN-γ低水平提示ICIs引起的肺炎，是其特异性指标。低基础水平的IL-6提示ICIs引起的结肠炎，而出现irAEs后的IL-6升高提示银屑病加重。高基础水平的IL-17提示结肠炎，但其检测试剂价格昂贵，且受目前临床细胞因子检测水平的限制。治疗后的瘦素低水平、可溶性CD163高水平及CRP表达上升均提示出现irAEs风险增加。细胞因子中IL-8和可溶性CD25同时低基础水平提示ICIs引起的结肠炎风险增加，而TNF-α和IFN-α2同时表达升高提示严重的irAEs。当趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL19联用，其低基线水平提示irAEs风险增加；而ICIs治疗后趋化因子CXCL9、CXCL10、CCL5和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)均升高提示irAEs风险增加。将G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、分型趋化因子、成纤维细胞生长因子-2、IFN-α2、IL-12p70、IL-1a、IL-1b、IL-RA、IL-2和IL-13联用，进行综合评分，高基础水平评分和治疗后评分均提示出现irAEs风险增加。

微生物组学方面的标志物包括厚壁菌门粪杆菌属、拟杆菌和与多胺转运系统、硫胺素、核黄素、泛酸盐合成有关的微生物代谢产物，其相关指标的基线水平上升均会增加出现irAEs的风险，而拟杆菌和微生物代谢产物相关指标是提示ICIs引起的结肠炎的特异性指标。遗传学标志物包括HLA-DR4表型、CD177和癌胚抗原细胞黏附因子1(CEACAM1)，HLA-DR4与ICIs引起的糖尿病有关，治疗后的CD177和CEACAM1升高，提示irAEs风险增加。最后是影像学指标胸部CT，其评分升高与ICIs引起的肺炎有关，具有良好的灵敏度和特异度。

3 ICIs相关生物标志物的临床应用

目前，经过Ⅲ期临床试验验证的生物标志物仅有TMB和PD-L1，虽然它们已是临床应用ICIs的常规监测指标，但其仍有一些缺陷。在非小细胞肺癌中，帕博利珠单抗的应答率在高水平PD-L1表达的情况下为45%～50%，但在无PD-L1表达的情况下其应答率仍有10%～15%。并且在两个独立的CTLA4抗体治疗黑色素瘤患者的队列研究中发现，当SCNAs与TMB联用时，其对ICIs疗效的预测效果优于TMB[50]。可见，将潜在的生物标志物最终应用于临床还有很长的路要走。

而因功能障碍的终末器官不同，目前用于监测和诊断irAE的常规临床实验室检测方法包括用于肾炎的血清肌酐，用于肝炎的天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和胆红素，用于心肌炎或肌炎的肌钙蛋白和肌酸激酶，用于胰腺炎的脂肪酶及用于垂体炎和甲状腺炎等内分泌疾病的肾上腺皮质营养激素、皮质醇、促黄体生成激素、促卵泡激素、胰岛素样生长因子1、生长激素、TSH和游离甲状腺素等。但是，它们都无法为有关毒性的病理学、生理学机制提供有意义的见解或预测价值。且癌症患者治疗中常发生的肝肾功能障碍并不是ICIs诱导的宿主免疫增强所特有的。目前，虽然将这些常规的临床实验室检测指标作为一般推荐，但实际上支持这些参数的最佳筛查频率的证据也是缺乏的，而irAEs的其他生物标志物还处于早期探索阶段。

4 总结与展望

目前，ICIs治疗已被写入各种复发性恶性肿瘤和中晚期癌症的临床应用指南中，甚至能够跻身于Ⅰ级推荐。但由于在我国，一些ICIs尚未获得肿瘤治疗的适应证，且相关诊断试剂获批较晚，目前仍缺乏基于我国人群的相关研究及循证医学证据。虽然已有研究表明[50]ICIs确实对肿瘤有效且能延长患者的总生存期，但其具体机制尚未完全阐明，对其相关生物标志物的研究也处于早期探索阶段。随着检测技术的快速发展、相关医学技术的突飞猛进，相信在不久的将来，ICIs的作用机制将会进一步明确，其相关生物标志物的研究会进一步发展，早日应用到临床以指导癌症患者用药，延长患者生存期，提高患者生活质量。