脂质去除分散固相萃取-气相色谱-串联质谱测定鸡蛋中62 种农药残留

舒 晓，褚能明，张雪梅，孟 霞，李典晏，黄程兰，向 嘉，杨俊英

（重庆市农业科学院，农业农村部农产品质量监督检验测试中心（重庆），重庆 401329）

鸡蛋含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和人体所需的钙、铁、钾等矿物质，所含的蛋白质对肝脏组织损伤有修复作用，富含的DHA和卵磷脂、卵黄素有利于神经系统和身体的发育，能健脑益智，是中国家庭必备的食品之一，因此保障鸡蛋的食用安全具有重要意义。目前对鸡蛋中磺胺类[1-2]、喹诺酮类[3-4]、硝基呋喃等[5-6]等抗生素类药物的残留研究较多[7-9]，对农药残留检测的研究相对较少。但根据实地调研情况，大部分养殖场都对养殖环境进行了消毒、杀虫、防蝇。尤其是在天气炎热的夏季，如果畜禽动物通过食用直接或者间接受到农药污染的养殖水、饲料等将杀虫剂、杀菌剂引入体内富集，可能产出受到农药污染的畜禽产品或直接造成畜禽产品的农药污染[10-11]。长期食用农药残留超标的畜禽产品，可引起慢性中毒，甚至产生致畸、致癌和致突变作用[12-13]。由于2017年的“毒鸡蛋”事件，目前对鸡蛋中农药残留的检测研究大多与氟虫腈及其代谢物[14-16]有关或局限于部分有机氯农药[17]，检测的农药种类和范围较少。农药残留检测的前处理方式主要有固相萃取[18-19]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）等[20-21]，鸡蛋样品的农药残留检测前处理通常采用QuEChERS方法[22-23]。相应的检测方法主要有气相色谱法[24-25]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[26]、液相色谱-串联质谱法等[22,27-29]。目前采用气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）对鸡蛋中农药的多残留研究报道较少[23,30]。GC-MS/MS是由GC和两个四极杆质量分析器串联组成，通常第1个质量分析器将选定的母离子预分离，通过中间碰撞池碰撞产生子离子碎片，由第2级质量分析器筛选产生的特定子离子。因此具有灵敏度高、准确性强、有较强的抗干扰能力的优点，是农药残留分析领域的主要技术之一[31]。鸡蛋中脂肪质量分数约为10%～12%，在前处理方法中增加去除脂质的步骤对降低基质效应的影响同时减少对仪器的损耗可能有较好的作用，在部分水果和肉类样品的农药残留和环境污染物的检测研究中，增强型脂质去除（EMR-Lipid）已成功用于去除脂质[32]。本研究创造性的将EMR-Lipid用于鸡蛋样品前处理过程中去除脂质并结合GC-MS/MS进行检测。根据对养殖场的杀虫剂、杀菌剂使用情况调研，分析了鸡蛋中62 种农药残留检测情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

62 种农药标准品（纯度≥95%，质量浓度1 000 mg/L）德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司和美国Sigma-Aldrich公司；乙酸（优级纯） 成都市科龙化工试剂厂；乙腈（色谱纯） 天津四友有限责任公司；正己烷（色谱纯） 德国Meker公司；氯化钠（优级纯） 上海国光试剂有限责任公司；除水盐包（MgSO42.5 g、NaCl 0.5 g） 上海安谱试验科技股份有限公司；实验用水均为超纯水（电阻率18.2 Ω·cm）。

增强型脂质去除分散固相萃取（EMR-Lipid）净化管美国安捷伦科技公司；QuEChERS净化管（内填150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18） 天津阿尔塔科技公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-TQ8050三重四极杆质谱仪 日本岛津公司；SH-Rxi-5Sil MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；H1850R离心机 长沙湘仪离心机有限公司；WH-600超声波清洗机 济宁万和超声电子设备有限公司；Elix5超纯水系统 美国Millipore公司；SK-1快速混匀器 浙江省金坛市科析仪器有限公司；移液枪德国Eppendorf公司；T18-B-S25匀浆仪 德国IKA公司；TP-402天平 美国Denver公司；TTL-DCII型多功能氮吹仪 北京恒天科力科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

1.3.1.1 溶剂标准溶液的配制

用1 mL吸量管分别吸取质量浓度为1 000 mg/L标准品1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度线，配制成100 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱避光保存，有效期6 个月；用1 mL吸量管分别移取1 mL标准储备液于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度线，配制成2 mg/L混合标准溶液，于4 ℃冰箱避光保存备用，有效期3 个月。后续所需不同质量浓度溶剂标准溶液用2 mg/L混合标准溶液进行逐级稀释。

1.3.1.2 基质标准溶液的配制

用10 mL吸量管取1.3.1.1节所配混合溶剂标准溶液于10 mL容量瓶中，将溶剂氮吹近干后，用样品空白基质定容至刻度线。后续根据需要用样品空白基质进行逐级稀释。

1.3.1.3 基质效应计算公式

通过配制不同质量浓度梯度的溶剂标准溶液和基质标准溶液，分别绘制溶剂标准曲线和基质标准曲线溶剂，根据标准曲线斜率计算基质效应。计算公式如下：

1.3.2 样品前处理

首先将鸡蛋去壳并用匀浆仪充分均质后，准确称取5 g（精确至0.01 g）均质样品于50 mL离心管中，加入5 mL水，10 mL 1%乙酸-乙腈，涡旋混匀1 min，超声提取10 min。加3 g氯化钠后涡旋混合1 min，4 500 r/min离心10 min。吸取5 mL乙腈层加入到经过3 mL水活化的EMR-Lipid净化管中，涡旋1 min。在15 mL离心管中加入陶瓷均质子，将上述上清液倒入离心管中，加入除水盐包，涡旋振荡1 min，以9 000 r/min低温高速离心 5 min。取1 mL上清液待测。

1.3.3 色谱条件

毛细管色谱柱：SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；载气：氦气（纯度≥99.999%）；恒流模式，流速1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样；柱压73 kPa。柱程序升温：初始温度60 ℃，保持1.00 min，以30 ℃/min的速率上升到150 ℃，然后以10 ℃/min的速率上升到300 ℃，保持5.00 min；进样体积1.0 µL。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；离子化电压：70 V；碰撞气：氩气（纯度≥99.999%）；碰撞诱导解离气压：200 kPa；传输线温度：250 ℃；离子源温度：200 ℃；发射电流：150 µA；循环时间：0.3 s；分析模式为多反应监测扫描（multi reaction monitoring，MRM）模式。Q3SCAN全扫描模式下色谱条件与MRM扫描模式下的色谱条件一致，扫描范围：m/z80～500。

1.4 数据统计及图表绘制

采用岛津GC-MS Postrun Analysis和LabSolutions Insight GCMS对数据进行统计分析。采用GC-MS Postrun Analysis进行全扫描数据的导出，导出后的数据用Office Excel 2007作图。采用Office Excel 2007进行表格绘制、基质效应的数据分析和图片绘制。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

GC条件选择高纯度载气避免影响仪器正常工作以保证结果准确性。在进行微量组分分析时需选择不分流进样方式，在不分流进样方式下必须使用程序升温模式，且初温低于溶剂沸点10～20 ℃。每种农药在不同基质中定性定量离子对的响应可能有所不同，因此质谱条件的优化需通过对鸡蛋的基质标准溶液进行子离子全扫，比较在不同碰撞电压下离子响应丰度，选择信号强度好、响应稳定的定性定量离子对。本研究中的甲拌磷砜和毒死蜱保留时间为11.834 min和11.830 min，在GC图上难以区分，但它们的定性定量离子对不同，通过串联质谱即可将两种物质区别。为同时满足定性和定量的要求，在MRM模式下根据扫描的离子对数量设定扫描循环时间为0.3 s，使每个色谱峰的采集点在15 个左右。在以上色谱和质谱条件下62 种农药质量浓度为100 μg/L的离子对、碰撞能量等优化后的参数见表1。

表162 种农药GC-MS/MS分析的MRM参数Table 1GC-MS/MS parameters for analysis of 60 pesticides in selected reaction monitoring mode

续表1

续表1

2.2 提取剂的选择

乙腈作为提取溶剂适合提取的目标物极性范围最广，共提物少，并且农药在乙腈介质中较稳定，不经溶剂置换即可用于GC-MS分析，广泛应用于农药多残留分析。固相分散萃取前处理方法中也多以乙腈作为提取剂[33-34]。但在乙腈旳作用下，某些农药如三氯杀螨醇等易发生降解，在乙腈中添加1%的乙酸可作为分析物保护剂[35-36]。水的加入可增加极性农药的溶解度。因此本研究考察3 种提取剂组合对提取效果的影响，分别为10 mL乙腈+5 mL水、10 mL 1%乙酸-乙腈、10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水。取3 种不同提取剂的空白样品上清液不经净化步骤，直接上机，在SCAN模式下对3 种提取液进行全扫描。如图1所示，使用10 mL乙腈+5 mL水作为提取剂，基质效应最弱，背景干扰最小。采用含有10 mL 1%乙酸-乙腈作为提取剂时背景干扰较大。为验证3 种提取剂组合的提取效果，以加标回收实验结果为判定依据，结果如表2所示。62 种农药在用10 mL乙腈+5 mL水提取时，有64.5%的农药回收率在70%～120%之间。10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水作为提取剂时，98.4%的农药平均加标回收率为70.7%～117.2%。使用10 mL 1%乙酸-乙腈作为提取剂时，有46.8%的农药回收率在70%～120%之间，因此加入水可以更好的使农药集中到有机相中。结果表明10 mL 1%乙酸-乙腈+5 mL水作为提取剂的效果最好。

图1 Q3SCAN模式下3 种提取液空白基质全扫描图Fig.1 Chromatogram of blank samples with three different extraction solvent combinations in Q3SCAN mode

表2 不同溶剂组合的62 种农药添加回收率的影响Table 2 Statistical results of spiked recovery rates of 62 pesticides with different extraction solvent combinations

2.3 盐的选择

对比只加入3 g NaCl和加入4 g MgSO4+1 g NaCl两种盐组合的不同萃取效果。加标回收实验结果如表3所示。可以看到加入3 g NaCl的萃取效果优于加入4 g MgSO4+1 g NaCl的效果。4 g MgSO4的加入虽然使水相和有机相更容易分离，但与水产生了剧烈的放热效果，使一部分的农药受到损失。

表3 2 种盐组合对62 种农药添加回收率的影响Table 3 Statistical results of spiked recoveries of 62 pesticides with extraction solvents added with two different salt combinations

2.4 除脂的净化效果

鸡蛋中都含有一定量的脂肪，因此在净化步骤中考察了除脂与不除脂的实验效果。不除脂的方式为常用的QuEChERS方法，直接取1.3.2节所述前处理步骤中第1次离心后的上清液1 mL通过QuEChERS净化管（MgSO4、PSA、C18）后上机检测。选择的除脂方式有两种，一种为增强型脂质去除（EMR-Lipid），处理步骤同1.3.2节。另1 种采用正己烷溶剂除脂，正己烷也在许多研究工作种被用于出去脂肪[37]。具体方式为取1.3.2节所述步骤中第1次离心后的上清液5 mL于15 mL离心管中，加入5 mL正己烷，涡旋1 min后在4 500 r/min离心5 min，取下层有机溶剂1 mL上机检测。首先对直接经过QuEChERS净化管和经过两种除酯方式净化后的鸡蛋样品基质在SCAN模式下进行全扫，结果如图2所示。可以看出鸡蛋样品的空白基质经过两种去除脂质步骤的基线明显低于未除酯的基线。其中经过正己烷除脂后的背景干扰小于经过EMR-Lipid净化的背景干扰，在62 种农药的主要出峰区域，即在保留时间为4～6 min以及9～20 min之间，EMR-Lipid净化后的背景干扰也明显小于经过QuEChERS净化管的背景干扰。在保留时间为6～9 min时，虽然直接经过QuEChERS净化管的背景干扰较小，但是待测的62 种农药均不在在此区间出峰。为验证正己烷去脂、增强型脂质去除与不除脂直接通过QuEChERS净化管3 种净化方式的效果。以空白加标样品的回收率为判定依据，结果如表4所示。可以看到经过EMR-Lipid除脂净化后有98.4%的农药加标回收率为70.7%～117.2%，相对标准偏差为0.3%～10.9%。经过正己烷除脂后，由于六六六、滴滴涕等一部分农药在正己烷中有一定的溶解性，进入到正己烷层中，导致部分农药的回收率降低，仅61.3%的农药回收率范围在70%～120%之间。虽然正己烷除脂对降低背景干扰有优异的效果，但对回收率有较大的影响。QuEChERS净化的结果为90.3%的农药回收率范围在70%～120%之间，且部分农药相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）较大，检测精密度受到一定的背景干扰影响。所以增强型脂质去除为鸡蛋样品农药残留检测前处理步骤中较优的净化方式。

图2 Q3SCAN模式下除脂与不除脂的空白样品基质Fig.2 Chromatogram of blank samples with and without defatting treatment in Q3SCAN mode

表4 除脂与不除脂对62 种农药添加回收率的影响Table 4 Statistical results of spiked recoveries of 62 pesticides with and without defatting treatment

2.5 线性范围、定量限、回收率和精密度结果

用空白鸡蛋样品，根据1.3.2节前处理方法得到鸡蛋基质提取液，参考农药在仪器上的响应情况，根据1.3.2.2节所述步骤，用鸡蛋基质提取液准确配制5、10、20、50、100、200、300、400 μg/L 8 个不同梯度质量浓度的基质标准溶液。在1.3.3节仪器条件下，以农药的峰面积与质量浓度作标准曲线。结果表明，除α-硫丹、β-硫丹和咪鲜胺3 种农药外的59 种农药在5～400 μg/L之间线性关系良好，α-硫丹、β-硫丹和咪鲜胺3 种农药在50～400 μg/L之间线性关系良好。各农药的线性相关性系数均大于0.95。配制0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg/L 6 个低质量浓度的基质标准溶液和1、2、4、10、15 、20、50 μg/L 5 个较低质量浓度的基质标准溶液进样，由化学工作站计算出每个农药的信噪比，根据方法的检出限为3 倍的信噪比，定量限为10 倍的信噪比得出对应每种农药的检出限和定量限。结果表明除α-硫丹、β-硫丹和咪鲜胺3 种农药外，62 种农药中有59 种农药在信噪比为3左右时，对应的检出限为0.5～5.0 μg/kg之间，在信噪比为10左右时，对应的定量限在1.0～20.0 μg/kg之间，α-硫丹、β-硫丹和咪鲜胺的定量限较高为50 μg/kg。本实验采用鸡蛋的基质匹配液-外标法定量，按低、中、高3 个水平确定加标回收实验的添加量，在选择最低水平的添加量时，考虑到大部分农药的定量限为10 μg/kg和20 μg/kg，所以最低水平添加量为20 μg/kg。3 个不同水平的添加量分别为20、60 μg/kg和100 μg/kg，每个水平重复3 次，得到每种农药的平均回收率和RSD，结果如表4所示。当添加量为20 μg/kg时，除三唑酮、溴氰菊酯、p,p’-DDT以外，其余农药的回收率均在61.2%～115.0%之间，RSD为1.8%～18.4%，当添加量为60 μg/kg时，除p,p’-DDE和p,p’-DDT以外，其余农药的回收率在60.6%～116.3%之间，RSD在1.2%～23.3%之间，当添加量为100 μg/kg时，检测农药的回收率均在70.7%～117.2%范围内，相对标准偏差为0.3%～10.9%。通常GC法或GC-MS/MS法在检测鸡蛋中农药残留时，多采用固相萃取柱净化等复杂前处理方法，多残留检测时不能确保每种农药的检出限、定量限、回收率和RSD都得到好的结果，单残留检测时的结果通常更好，但检测效率较低。QuEChERS前处理方法比固相萃取柱净化的方法更简单快捷，得到的回收率和RSD等结果与GC以及GC-MS/MS法报道相比[23,28,30]，有检测范围广同时保证灵敏度好、精密度高的优点。与Zhang Xining等[22]一些液相色谱-串联质谱法的相关报道相比[27]，在回收率和精密度上能保持相当的结果。液相色谱-串联质谱检测时前处理方法通常为QuEChERS法同时受基质效应的影响更小，检出限和定量限通常更低。

表5 62 种农药的回收率、RSD和方法定量限Table 5 Recoveries, relative standard deviations and limits of quantitation of 62 pesticides

续表5

2.6 基质效应

鸡蛋中富含蛋白质、氨基酸、维生素等营养物质，基质效应往往会对分析准确性产生重要影响，因此有必要对此研究过程中鸡蛋样品的基质效应进行分析。分别配制质量浓度为1、2、4、10、15、20、50、100、200、400 μg/L的溶剂标准溶液和空白基质标准溶液，绘制了溶剂标准曲线和基质标准曲线。

根据1.3.2.3节基质效应的计算公式，基质效应在－20%～20%之间为弱基质效应，在－50%～－20%和20%～50%为中等基质效应，低于－50%或超过50%为强基质效应[38]。各组分农药的基质效应结果如图3所示，可以直观地看到采用GC-MS/MS法对鸡蛋中62种农药进行检测时，大部分农药都有不同程度的基质效应，并且多为基质抑制效应。仅有20 种农药为弱基质效应。31 种农药为中等基质效应。11 种农药为强基质效应。因此在结果分析中有必要通过基质标准曲线进行校正。

图3 62 种农药的基质效应Fig.3 Matrix effects for 62 pesticides

2.7 实际样品分析测定

从重庆市各区县养殖场和农贸市场中随机抽取了40 份鸡蛋样品，对方法进行验证。其中有2 份样品有检出，检出农药分别为联苯菊酯和氟虫腈硫醚，检出比例为5%。其中联苯菊酯检出量为6.9 μg/kg，氟虫腈硫醚检出量为17.0 μg/kg，氟虫腈硫醚的检出浓度超过了欧盟标准规定的蛋类食品最大残留限量值5 μg/kg，未超过我国GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》以及国际食品法典委员会规定的20 μg/kg最大残留限量值。在以往的一些研究中也有氟虫腈及其代谢物的检出[22,39]，表明杀虫剂的非法使用在畜禽养殖过程中应引起重视。实际样品的检测结果也表明基质增强去除脂质结合GC-MS/MS在鸡蛋中的农药残留检测有较好的实际应用价值。

3 结 论

采用GC-MS/MS法对鸡蛋中农药多残留进行了检测分析。1%乙酸-乙腈作为溶剂，氯化钠盐析，采用基质增强去脂分散固相萃取对有机相进行净化，有效去除了鸡蛋中的脂肪成分，与常用的QuEChERS净化法相比得到了更为优异的回收率和重复性结果。该方法前处理步骤简单快捷、灵敏度高、专属性强及重复性好，并成功应用于鸡蛋样品的分析，为鸡蛋中多种农药残留量的监测提供了有力的技术手段，为限量值的制定提供了相应的数据基础，保障了鸡蛋的安全食用。