烟草根结线虫病生防菌株TB-68的鉴定及室内防效测定

付 博，张 洁，张蒙蒙，都亚飞，王 静*，彭建斐*

1.河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002 2.河南省农业科学院植物保护研究所，郑州市花园路116号 450002 3.湖南省烟草公司怀化市公司，湖南省怀化市鹤城区湖天南路446号 418000

烟草根结线虫病是世界各国烟草生产中最重要的线虫病害之一［1-3]。由于我国大部分烟田长期连作，土壤中的线虫基数逐年增多，根结线虫病目前已成为我国烟草产区的主要病害［4-6]。根结线虫主要侵染烟草根系并形成根结或结瘿，破坏根组织的分化和生理活动，导致植株出现叶尖、叶缘干枯内卷症状。根结线虫侵染烟草根部造成的伤口还会促进其他真菌和细菌性病害的侵染，严重影响烟叶的产质量。然而生产上为防控烟草根结线虫病使用的化学杀虫剂危害人畜健康并污染生态环境［7]，随着人们对烟叶安全性的日益关注，烟草根结线虫病的生物防治也越发重要［8-9]。生物防治具有持效期长、对生态安全、对人畜友好等优点，在农业可持续发展模式中发挥着重要的作用［10]。翟 明 娟 等［11]研 究 发 现 绿 色 木 酶（Trichoderma viride）发酵液对根结线虫二龄幼虫的校正致死率高达98%，田间防效达到64.9%；黄金玲等［12]通过盆栽研究发现巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）对番茄根结线虫病的防效达60%；唐佳频等［13]报道南极土壤来源的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）生防效果可以达到71.67%，显示出生物防治在根结线虫绿色防控中的巨大应用前景［14]。目前，淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）、坚强芽胞杆菌（Bacillus firmus）、穿刺巴氏 杆 菌（Pasteuria penetrans）、蜡 质 芽 胞 杆 菌（Bacillus cereus）等［15-17]生防微生物已在多个国家被开发成商品制剂并用于根结线虫的生物防治。此外，贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）也被应用于多种作物根结线虫病的生物防治中，Burkett-Cadena等［18]报道贝莱斯芽胞杆菌FZB42菌株能够减少番茄根部线虫卵和幼虫数量，且能有效减轻番茄灰霉病的发生；Xiang等［19]报道贝莱斯芽胞杆菌Bve2菌株能够降低棉花根系中根结线虫卵囊的数量，并能显著增加棉花的产量。但目前关于烟草根结线虫病生物防治的相关研究还较少，亟需探索对烟草根结线虫具有生物活性的新生防资源。为此，本研究中对前期筛选出的生防细菌进行种类鉴定，并对其防治效果及生防机理进行初步研究，旨在为新型生物杀线虫剂的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 烟草品种、供试菌株及烟草根结线虫根结

供试烟草品种为云烟87。TB-68菌株由烟草根结线虫卵囊上分离获得。在河南省洛阳市宜阳县严重发生根结线虫病的烟田中采集烟株发病根结［前期鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）]，用于室内离体活性测定和盆栽防效测定。

1.1.2 培养基

营养琼脂培养基（NA）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂17 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2；营养肉汤培养基（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3 试剂

总糖含量测定试剂盒以及考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒均购于苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株鉴定

将TB-68菌株在NA培养基上划线，32℃培养15 h，观察菌落特征并进行扫描电镜观察和革兰氏染色，观察其菌体大小、形状、有无芽胞。利用CTAB法提取TB-68菌株的基因组DNA，采用通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增其16S rDNA基因序列。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果用BLAST软件与GenBank中的已知序列进行比对。采用Mega 5.0软件对TB-68菌株进行系统发育树构建。

1.2.2 室内离体活性测定

从烟草根结线虫病烟田取发病根结并用清水冲洗干净，剪成0.5～1.0 cm小段，1%（质量分数）次氯酸钠消毒2 min，用玻璃棒拍打、收集卵粒，经无菌水冲洗并离心得2 000粒/mL的卵粒悬液，将卵粒悬液置于28℃的恒温箱中孵化5～7 d后收集二龄幼虫，经冲洗与离心得2 000条/mL的线虫悬液。将TB-68菌株接种于NB培养基，28℃，160 r/min振荡培养16 h后，10 000 r/min离心2 min，用0.22μm的微孔滤膜滤除菌体，得发酵滤液原液，并依次稀释制备5倍和10倍稀释液。分别测定发酵滤液原液、5倍和10倍稀释液对根结线虫二龄幼虫的致死作用和对卵孵化的抑制作用。具体方法：吸取200μL菌株发酵滤液加入到1.5 mL离心管中，再向其中加入50μL线虫悬液混合均匀，以空白液体培养基为对照，重复6次，置于25℃培养箱中，48 h后观察二龄幼虫的死亡情况，通过滴加4%（质量分数）NaOH溶液判断线虫的死活［20]，计算线虫死亡率和校正死亡率［21]。吸取200μL菌株发酵滤液和50μL卵悬液至1.5 mL离心管中，以空白液体培养基为对照，每处理重复6次，置于25℃恒温箱中培养，7 d后调查各处理中孵化出的二龄幼虫的数量，计算孵化率和卵孵化抑制率［21]。

1.2.3 室内盆栽防效测定

将TB-68菌株接种于NB液体培养基，28℃，160 r/min振荡培养至OD值为0.8～1.0，得TB-68发酵液。采用漂浮育苗，待烟苗长到5～6片真叶时，选取健壮、长势一致的幼苗移栽于装有无菌土的花盆（10 cm×12 cm）中，每盆移栽1株烟苗，移栽3 d后进行灌根和施药处理，具体方法：（1）TB-68发酵液100 mL/株灌根；（2）TB-68发酵液200 mL/株灌根；（3）0.5%（质量分数）阿维菌素颗粒剂2 g/株穴施；（4）空白培养基对照。灌根和施药5 d后接种根结线虫，在距离烟草根2 cm处的无菌土中对称打2个1 cm深的小孔，注入二龄幼虫悬液，每株接种1 000条。每处理10个重复，浇透水后放在28℃人工气候室内培养，移栽60 d后，根据GBT23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行病情调查，并计算根结指数和防治效果［22]。

根结指数＝Σ（各级病株数×级别）/调查总株数

防治效果＝（对照根结指数-处理根结指数）/对照根结指数×100%

1.2.4 TB-68菌株生防机理初步研究

将从病田取回的根结用清水冲洗干净，剪成0.5 cm的小段，在体视镜下用灭菌的牙签轻轻挑取卵囊，用1%（质量分数）次氯酸钠表面消毒1 min，用无菌水冲洗3次。参考1.2.2方法制备TB-68发酵滤液原液，测定TB-68发酵滤液处理对根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量的影响。各处理取饱满且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL离心管中，每管加入1 mL TB-68发酵滤液，以加入等量的无菌LB培养基为对照，密封置于25℃培养箱中培养24 h，按照说明书要求测定卵囊总糖和总蛋白的含量（质量分数），重复3次。

1.3 数据分析

采用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差分析，利用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

在NA培养基上培养15 h，TB-68菌株的菌落均呈乳白色不透明、表面粗糙、质地紧密、中央有凹陷、边缘不规则形态，菌体呈短杆状，大小为2.33μm×0.58μm，革兰氏染色阳性，芽胞中生（图1）。测定TB-68菌株的16S rDNA的序列，经与NCBI数据库进行BLAST比对分析，相似性最高的为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）。利用其近缘序列构建系统发育树。结果显示，TB-68菌株与贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）处于进化树的同一分支（图2），结合形态学特征，将TB-68菌株鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）。

2.2 TB-68菌株对烟草根结线虫的室内离体活性测定

由表1可见，随着TB-68菌株发酵滤液稀释倍数的增加，线虫的死亡率逐渐降低，卵孵化率逐渐增高。其中，TB-68发酵滤液原液处理中根结线虫二龄幼虫的死亡率达94.5%，显著高于其他处理和对照，校正死亡率达91.7%，其5倍稀释液和10倍稀释液处理中的线虫死亡率也显著高于对照，校正死亡率分别为67.2%和39.2%。此外，TB-68菌株发酵滤液原液处理中的卵孵化率最低，为12.8%，而对照中的卵孵化率为70.5%；卵孵化抑制率达到81.8%，5倍稀释液和10倍稀释液处理的卵孵化抑制率分别为59.6%和39.4%。

表1 TB-68菌株发酵滤液对根结线虫的室内离体活性测定①Tab.1 In vitro activity test of TB-68 fermentation filtrate on tobacco root knot nematode in greenhouse （%）

2.3 室内盆栽防效测定

室内盆栽试验发现（表2），TB-68发酵液200 mL/株灌根处理和100 mL/株灌根处理对烟草根结线虫均有一定的防治效果，根结指数均明显低于对照。其中，TB-68发酵液200 mL/株灌根处理的根结指数为27.9，防治效果达64.4%，接近0.5%阿维菌素的防治效果；TB-68发酵液100 mL/株灌根处理的根结指数为38.6，防治效果为50.8%。由此可见，TB-68菌株具有较好的生防潜力。

表2 TB-68菌株对南方根结线虫盆栽防治效果的影响Tab.2 Control efficiency of TB-68 strain against Meloidogyne incognita in pots

2.4 TB-68菌株发酵滤液对根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量的影响

由图3可见，TB-68发酵滤液处理24 h后，根结线虫卵囊总糖含量和总蛋白含量分别为8.1 g/L和22.1 g/L，对照组根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量量分别为14.9 g/L和50.6 g/L，分别比对照显著降低45.6%和56.3%，说明TB-68菌株发酵滤液处理能够显著降低根结线虫卵囊的总糖含量和总蛋白含量。

3 讨论

本研究中鉴定前期从烟草根结线虫卵囊上分离得到的生防细菌TB-68菌株为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis），并发现TB-68菌株发酵液200 mL/株的灌根处理对烟草根结线虫病的室内防治效果较高（64.4%），接近0.5%阿维菌素2 g/株穴施处理的防治效果，可为烟草根结线虫病的防控提供新的生防资源，对该病的绿色防控具有重要意义。此外，生防菌株的定殖能力是其发挥防效的前提，也是评价该菌株生防潜力的重要因素［23]。根据Al-Ali等［24]的研究，贝莱斯芽胞杆菌在番茄根际周围具有较强的定殖能力，从而表现出良好的防治效果，推测本研究中TB-68菌株在烟田中较高的防效可能与TB-68菌株在烟草根际土壤的稳定定殖能力有关，下一步将验证TB-68菌株的田间防治效果及其在土壤中的定殖能力，以期为TB-68菌株的开发利用提供依据。

本研究中还发现贝莱斯芽胞杆菌TB-68发酵滤液对烟草根结线虫二龄幼虫具有较强的致死作用，且对其卵囊孵化具有较强的抑制作用，推测TB-68菌株发酵产生的次级代谢产物对根结线虫具有较强的生物活性，从而抑制烟草根结线虫病的发生。另外，研究中发现TB-68发酵滤液能够显著降低线虫体内的总糖和总蛋白含量。糖是线虫化学感受器的重要组成物质进而影响着线虫的趋向性，线虫体表的蛋白质角质层可保持线虫体内水分稳定并能阻止生防菌或其他有害物质的侵入［25]。因此，TB-68菌株很可能是通过其发酵滤液干扰线虫糖和蛋白质的代谢活动，破坏了烟草根结线虫卵和二龄幼虫的体壁及内部结构组成，进而导致线虫死亡，该推测与Choi等［26]报道的结果相符。

4 结论

从烟草根结线虫卵囊上分离得到的1株生防细菌TB-68，通过形态及分子特征分析将其鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）。该菌株发酵滤液原液对根结线虫二龄幼虫的校正死亡率达91.7%，卵孵化抑制率达到81.8%，室内盆栽防治效果达64.4%，并能显著降低根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量，在烟草根结线虫病的生物防治方面具有较大应用潜力。