线粒体损伤在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

肖卫纯，安 威

首都医科大学细胞生物学系 肝脏保护与再生调节北京市重点实验室，北京 100069

临床上，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被定义为一种与酒精性肝炎病理改变类似，但没有饮酒史的慢性肝病。1990年当NAFLD首次被提出，就有人怀疑它是否是一种真正意义上的肝脏疾病。到了上一世纪末，人们对NAFLD认识不断清晰，认为它可能是代谢综合征的肝脏表现，因此，最近有人提出以代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)命名取代NAFLD。但MAFLD命名也存在某些争议，例如，在许多亚洲国家，特别是农村地区，NAFLD患者常常不伴有肥胖，而表现为瘦人脂肪肝。因此，NAFLD与代谢综合征的关系还需认真厘清。抛开命名上的纷争，过去30年，包括北美、欧洲、亚洲等许多国家报道，NAFLD发病率明显升高，已经成为世界上最重要的慢性肝病之一。一项回顾性分析表明，NAFLD患病率已达全球总人口的25%。有理由相信，NAFLD将是本世纪乃至下一世纪危害人类健康的重要肝病。此外，值得一提的是，少部分NAFLD患者可不经非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中间环节而直接发展成肝纤维化、肝硬化等进展性肝病。虽然NAFLD与肝癌(HCC)发病率之间还缺乏可信的大规模流调数据，但据报道，约有4.1%的NAFLD患者存在HCC患病风险，NASH或许是继HBV和HCV之后，引发HCC发生的致病因素。有关NAFLD/NASH的发病机制虽经几十年的研究，依然不甚清晰，随着“两次打击”学说受到冷落，“多次打击”学说逐步被接受。然而，导致NASH发病的始动因子(因素)仍不明确，其信号通路依旧模糊，已经成为困扰肝病学界的瓶颈问题。已知，游离脂肪酸在NASH发病中发挥重要作用，能否将脂肪酸从头合成的量控制在合理范围，或者将摄入的多余脂肪/糖转入线粒体彻底燃烧掉，被认为是控制NASH发生发展的核心环节。本文就线粒体损伤在NAFLD发病中的作用作一综述。

1 线粒体与脂肪代谢

1.1 线粒体结构及功能 线粒体是由外膜、内膜双层膜结构围成的细胞器，内外膜之间称为膜间隙，内膜向内凹陷，形成线粒体基质。线粒体外膜较光滑，含脂质代谢相关的酶，如脂酰CoA合成酶、脂肪酸激酶等；线粒体内膜高度复杂，包含有电子传递链(electronic transport chain,ETC)或称为呼吸链、ATP合酶和转运蛋白等。基质中含有三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)、丙酮酸和脂肪酸氧化、氨基酸代谢等有关的酶类，催化TCA以及脂肪酸的氧化(fatty acid oxidation,FAO)。人线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)也存在于基质中，由13个结构基因组成，编码呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的部分蛋白[1]。

线粒体的主要功能是对糖、脂肪和蛋白质等各种能源物质进行氧化和能量转换，是贮能和供能的场所，在细胞生命活动中，95%的能量来自线粒体。丙酮酸和脂肪酸从细胞质进入线粒体，被进一步氧化形成乙酰辅酶 A(coenzyme A,CoA)，进入TCA循环，经一系列酶促反应、电子传递和氧化磷酸化，供能物质被彻底氧化，分解为CO2和H2O，同时释放出大量能量，最终生成ATP。氧化过程中生成的质子(H+)以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)和黄素腺嘌呤二核苷酸(dihydroflavine-adenine dinucleotide,FAD)为递氢体，通过ETC传递电子时，将质子从线粒体基质泵入膜间隙，从而产生跨内膜的电化学梯度，称为线粒体跨膜电位。当H+通过ATP 合酶复合体中的质子通道进入基质时，ATP合酶利用电化学质子梯度的能量催化ADP与Pi合成ATP，使释放的能量以高能磷酸键的形式储存于ATP中(图1)。过量的电子流向ETC生成ROS，在正常情况下，线粒体消耗的氧有1%～2%会生成ROS[2]。

1.2 肝脏脂肪的代谢 肝脏中脂肪酸的来源主要包括三个途径即饮食、脂肪组织的脂解或从头合成脂肪。脂肪酸从小肠吸收，组装成富含脂蛋白的颗粒(乳糜微粒)并分泌到血液中。大部分长链脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFA)通过乳糜微粒被输送到脂肪组织，其余的被肝脏吸收。吸收至肝脏中的LCFA去路主要有两条：(1)分泌出肝脏。游离脂肪酸转化为复杂的脂质分子，包装成极低密度脂蛋白分泌出肝脏；(2)留在肝脏中代谢。肝细胞中LCFA被转运到线粒体，通过β-氧化被逐步分解，产生的乙酰CoA通过TCA循环彻底氧化，并以NAD+和FAD为递氢体，生成NADH和FADH2，通过氧化磷酸化生成ATP和H2O。

2 线粒体脂肪酸代谢相关酶障碍与NAFLD

2.1 肉碱脂酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase-1/2,CPT-1/2) 前述，长链脂肪酸需运至线粒体才能进一步氧化。CPT-1是脂肪酸β-氧化的限速酶，位于线粒体外膜，催化长链脂酰CoA和游离肉碱形成脂酰肉碱，进入线粒体膜间隙，进而在线粒体内膜的肉碱-脂酰肉碱转位酶作用下，通过线粒体内膜转运至线粒体基质。进入线粒体基质的脂酰肉碱在线粒体内膜基质面的CPT-2催化下重新解离为脂酰CoA和游离肉碱。线粒体基质中含有β-氧化的所需酶类，催化脂酰CoA进行β-氧化(图1)。CPT-1的活性受丙二酰CoA调节，饱食后脂肪合成增加时，丙二酰CoA增加，抑制 CPT-1的活性，进而减少β-氧化。在脂肪肝的起始或者发生过程中，CPT-1的作用比较复杂。有报道[3]称，当肝脏处于脂肪肝阶段，CPT-1表达升高，脂肪酸氧化增加。但是在连续4周喂食蛋氨酸-胆碱缺陷(methionine-and choline-deficient diet,MCD)的NASH大鼠模型体内发现，CPT-1的mRNA表达及蛋白表达均升高，但是其活性降低，脂肪酸氧化的关键酶3-羟脂酰CoA 脱氢酶活性也下降，导致肝细胞线粒体内FAO下降[4]。饮食诱导的肥胖小鼠，过表达具有活性但对丙二酰CoA不敏感的CPT-1可以导致FAO持续上升，使肥胖小鼠的脂肪肝、炎症、胰岛素抵抗等症状有所减轻[5]。笔者团队[6]也证实，给小鼠转染荷载肝脏再生刺激因子(augmenter of liver regeneration,ALR)质粒，可以提高小鼠肝脏CPT-1活性，抑制MCD饲喂动物导致的肝脏脂质堆积，减轻动物脂肪肝。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ：电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ；CytC：细胞色素C。长链脂肪酸通过脂酰CoA合成酶催化为脂酰CoA，由CPT-1催化与肉碱结合为脂酰肉碱进入膜间隙，生成的脂酰肉碱在肉碱-脂酰肉碱转位酶的作用下进入基质，由CPT-2催化重新分解为脂酰CoA和肉碱；脂酰CoA经β-氧化生成乙酰CoA，乙酰CoA经过三羧酸循环彻底氧化。由β-氧化和三羧酸循环产生的氢离子以NADH 和 FADH2为递氢体，通过ETC传递链传递电子，耦联质子从线粒体基质泵入膜间隙，产生跨内膜的电化学梯度，当质子通过ATP 酶复合体中的质子通道进入基质时，ATP 合酶利用电化学质子梯度的能量催化ADP与 Pi合成ATP，产生H2O。图1 线粒体与脂类代谢

2.2 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1 (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1,PGC-1) PGC-1的基本功能是刺激线粒体的生物合成和氧化代谢，PGC-1家族成员包括PGC-1α、PGC-1β和PGC相关的共激活子(PGC-related co-activator,PRC)。PRC存在于所有组织中，并参与调节电子传递链的功能[7]；PGC-1α和PGC-1β共同激活多种核受体和转录因子，包括PPARs和核呼吸因子1/2 (nuclear respiratory factor 1/2,NRF1/2)，激活FAO和氧化磷酸化的基因的表达，例如CPT-1和脂酰CoA脱氢酶[8-9]。NAFLD患者肝脏PGC-1α表达下降可达40%，同时伴有线粒体功能障碍，脂质堆积[10]。肝脏特异性PGC-1α缺失可导致小鼠肝线粒体氧化能力受损，肝脂肪变性[11]。体内和体外过表达肝PGC-1α可刺激线粒体酶合成、提高线粒体功能，减少甘油三酯的堆积[12]。肝脏特异性过表达PGC-1β，诱导TCA循环和呼吸链上氧化磷酸化相关蛋白的表达，改善线粒体功能，减轻高脂饲料喂养导致肝脂肪堆积，以及由于脂肪性堆积引发的氧化应激反应，最终减轻脂肪变性，保护肝脏[13]。

2.3 一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK) AMPK作为细胞能量感受器,可以感受到AMP/ATP比值变化。AMP/ATP比值增加会刺激AMPK的活化，减轻NAFLD。AMPK主要通过三个方面调节脂质代谢(图2)；(1)通过PGC-1调节线粒体生物合成，提高线粒体质量。(2)AMPK通过乙酰CoA羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，ACC)-CPT-1途径，调节脂类氧化。AMPK磷酸化ACC1的Ser79和ACC2的Ser221，降低丙二酰CoA生成，抑制脂质从头合成；另外使线粒体脂肪酸转运限速酶CPT-1活性的增加[14]，促进FAO，减轻NAFLD[15]。在人肝细胞系LO2中，过度表达AMPK增加CPT-1表达，同时伴随着含脂肝细胞数量的减少[16]。(3)AMPK抑制脂肪酸从头合成。AMPK直接调控脂肪生成固醇调控元件结合蛋白-1c/2 (sterol regulatory element-binding protein-1c/2,SREBP-1c/2)的磷酸化，抑制其活性。作为转录因子，SREBP-1c调节脂肪合成酶(fatty acid synthase,FAS)以及ACC的表达，SREBP-2控制胆固醇合成和摄取基因的转录[17]。AMPK可通过SREBP-1c下调脂肪生成基因的转录表达，减轻脂肪肝[18]。笔者团队[19]证实，在MCD诱导的NAFLD小鼠模型中，SREBP-1c、SREBP-2活性增加，而抑制ALR表达通过阻止AMPK活化导致SREBP-2活性增加，使低密度脂蛋白受体表达，促进胆固醇内流，加重NAFLD。小鼠肝脏特异性激活AMPK可导致脂质合成降低，保护肝脏避免发展为NAFLD[20]。

注：肝脏所吸收的脂肪主要在肝脏进行代谢。CPT-1是脂肪酸转运的限速酶，催化长链脂肪酸由胞质转入线粒体进行β-氧化。CPT-1表达或活性下降导致脂肪堆积；脂肪酸在线粒体通过β-氧化分解为乙酰CoA,转运出线粒体，在胞浆中参与脂质从头合成，合成的丙二酰CoA抑制CPT-1的活性，并且受到AMPK的调节;AMPK活性增加，导致ACC磷酸化而活性下降，丙二酰CoA合成减少，CPT-1的活性增加；AMPK活性降低时，SREBP活性增强，脂类合成(ACC,FAS)和胆固醇合成的相关蛋白和酶类增加，促进脂质和胆固醇合成，导致脂质堆积。PGC-1通过NRF1/2、ERR等转录因子调节线粒体电子传递链的生物合成以及FAO和氧化磷酸化所需酶类；活性增高时，促进CPT-1的表达，FAO增多。图2 线粒体脂类代谢障碍与脂肪堆积

3 氧化磷酸化解耦联

线粒体解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)是定位于线粒体内膜的载体蛋白，介导质子从膜间隙转运至基质(质子漏)，负责底物的氧化磷酸化解耦联，使能量以热能的形式释放，参与调节线粒体脂肪酸代谢，转录因子SP1可调节UCP2的表达[21]。理论上，UCP2 通过质子泄漏可能允许线粒体中脂肪酸β-氧化增加，支持持续的脂肪酸氧化[22]。但实践中发现，肥胖小鼠(ob/ob)敲除UCP2基因，与非敲除小鼠相比，脂肪变性程度并未明显减轻[23]。在脂肪肝第二次打击中，上调UCPs表达可能促进呼吸链中的电子释放，从而防止大量线粒体ROS生成，稳定细胞脂质过氧化反应，减轻炎症[24]。然而，从NAFLD动物模型肝脏以及NASH患者肝活检组织中发现，虽然肝细胞中UCP2表达增加[25-26]，ROS含量并未下降。对于这种理论上可以保护肝细胞而实际上却未能减轻NAFLD的现象，研究者们推测，增高的UCP2表达量不足以缓解脂肪肝内过度产生的ROS，而且因为UCP2对于氧化与磷酸化解耦联，底物氧化并未产生ATP，ATP生成减少，导致肝脏对外界刺激更易感[27]。另外，与正常细胞相比，UCP2在脂肪肝中的定位发生了改变。在正常的肝脏中，UCP2主要在Kupffer细胞表达，肝实质细胞比较少；与之相反，在脂肪肝，UCP2在肝实质细胞中高表达，巨噬细胞中减少，并且ROS产生增加[26]。下调NAFLD大鼠肝组织UCP2的表达，促进肝细胞脂肪肝的恢复，改善脂质代谢[28]。

与UCP2未能缓解脂肪肝的进程相比，另外一种解耦联剂HDMCP却可能缓解脂肪肝的发展，序列分析表明，HDMCP和UCPs具有序列相似性[29]。在MCD诱导的小鼠NASH 模型以及由脂肪酸诱导的脂肪肝细胞中，HDMCP的表达增高，并且沉默HDMCP后，脂肪肝变得更严重[30]。

4 线粒体生物氧化障碍与NAFLD

电子通过ETC传递时，部分电子直接与氧反应形成自由基超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)等。线粒体是产生ROS的主要场所(90%)。在正常的生理条件下，线粒体ETC过程中产生的这些自由基会被抗氧化酶(如超氧化物歧化酶)和过氧化氢酶清除。超氧化物歧化酶可以使O2-自发分解为氧气和H2O2，再通过线粒体谷胱甘肽过氧化物酶解毒，转变成水。当细胞内ROS产生超过抗氧化系统的清除能力时，导致细胞内氧自由基积聚，过多的氧自由基会破坏细胞的结构和功能，称为氧化应激。过多的ROS将攻击细胞内的大分子，导致mtDNA、脂质、蛋白质的氧化修饰，并损伤大分子，改变膜电势，诱导肝损伤。在NAFLD小鼠，ROS显著增多，而线粒体是主要的ROS来源[31-32]。过量的肝脏脂肪诱导细胞氧化还原状态的改变和生物大分子氧化损伤的积累[33]。在NASH患者中，H2O2、脂质过氧化物以及氧化DNA损伤(8-脱氧鸟苷)增加，抗氧化防御能力降低[34]。MCD诱导的脂肪性肝炎大鼠中也可检测到大量脂质发生过氧化[35]。笔者团队[36-37]研究证实，在由MCD以及HFD诱导的NAFLD小鼠模型中，ROS的升高，ATP生成减少。H2O2下调 PPARα的表达，抑制CPT-1，导致 FAO减少；同时H2O2促进FAS的表达，促进脂质合成[38]。

5 线粒体生物合成障碍与NAFLD

通俗上讲，线粒体生物合成是由已经存在的线粒体产生新的线粒体的自我更新过程，这一过程中，线粒体DNA、蛋白质和线粒体膜都来自于母线粒体的分裂。因此，线粒体无法从头合成。涉及线粒体生物合成的机制仍然不很清楚。目前研究[39-40]表明，PGC-1是线粒体生物合成的主要调节因子,PGC-1α提高NRF1/2 的表达并与之结合提高线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)和转录因子B蛋白，后者调节mtDNA的复制和转录[41-42]，进而提高线粒体质量和氧化磷酸化能力。雌激素相关受体(estrogen-related receptor,ERRs)也是PGC-1α的下游目标[43]，ERR-α调节核基因编码的线粒体相关因子的转录，包括参与氧化磷酸化、FAO、TCA循环和线粒体分裂及融合的相关基因。

有报告[44]显示，在 NAFLD患者以及MCD诱导小鼠肝组织中，线粒体代谢和细胞器生成的关键调控因子，即 PGC-1、TFAM和NRF-2的表达水平均下降。部分NASH患者mtDNA缺失，肝细胞mtDNA编码的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和核DNA编码的酶复合物活性下降[45]。与在患者肝脏发现的一致，NAFLD小鼠模型中具有相似的线粒体功能障碍。在大鼠原代肝细胞中过度表达PGC-1α可导致线粒体标志物含量增加(例如，柠檬酸合酶，线粒体DNA和电子传递链复合物)以及线粒体功能增强、FAO也随之增加。

6 线粒体质量控制与NAFLD

6.1 线粒体分裂/融合与动态平衡 正常生理状态下，线粒体分裂和融合处于一种动态平衡。线粒体分裂/融合由一套相关蛋白质进行调控。线粒体外膜的融合由线粒体融合蛋白1/2(mitofusins，Mfn1/2)介导,而线粒体内膜的融合由视神经萎缩蛋白1(optic atrophy protein 1,Opa1)调节[46-48]；线粒体的分裂由线粒体分裂蛋白1 (fission 1,Fis1)，线粒体分裂因子 (mitochondrial fission factor,Mff)和线粒体动力蛋白49/50(mitochondrial dynamics proteins 49 and 51,Mid49/51)募集并激活动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)完成[49-51]。在自噬过程中，线粒体通过 cAMP/PKA/AMPK级联反应促进Drp1磷酸化抑制分裂，并使线粒体延长而维持细胞存活[52]。由HFD诱导的NAFLD小鼠模型中，肝脏线粒体呈现为小而圆，伴有线粒体片段化，线粒体分裂蛋白Fis1 和 Drp1表达增高，融合蛋白Mfn2表达降低，导致线粒体分裂/融合稳态失衡。特异性肝脏敲除mfn2的小鼠炎症加重，甘油三酯的聚集增加，最终导致肝纤维化和HCC[53]。

6.2 线粒体自噬 损伤的线粒体或碎片化线粒体可以通过线粒体自噬方式加以清除，以控制线粒体的质量，维持线粒体稳态。线粒体膜电势降低(即线粒体去极化)可以启动线粒体自噬过程。线粒体膜电势降低后，PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)转位至线粒体，募集并激活底物Parkin(一种E3-泛素连接酶)，导致线粒体膜蛋白的泛素化降解。NAFLD小鼠模型中线粒体自噬普遍下降，而增加线粒体自噬，可去除损伤线粒体，同时也能减缓NAFLD进程[54-55]。在与肥胖相关的NAFLD中，Parkin相关的线粒体自噬增高，维持线粒体稳态和肝细胞的存活；而巨噬细胞刺激因子通过AMPK抑制Parkin依赖的线粒体自噬加重NAFLD 肝损伤[56]。

6.3 线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR) mtUPR是一种线粒体应激反应，激活线粒体分子伴侣蛋白和核编码的相关蛋白酶的转录，在细胞核和线粒体之间建立通讯，并重建线粒体蛋白平衡。线粒体分子伴侣蛋白能够帮助错误折叠的蛋白恢复正常的构象，帮助新合成的蛋白正确折叠，主要包括热休克蛋白家族成员90 (heat shock protein 90,HSP90)、HSP60、HSP10。HSP90 通过稳定SREBP，提高SREBP靶向基因的表达[57]，调节PPARγ的活性[58]，促进脂质合成，增加脂质堆积。

7 线粒体膜去极化与NAFLD

线粒体内外膜存在一定数量的，由线粒体内外膜多种蛋白质组成的非选择性孔道，称为线粒体膜通透性孔道(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)。可以无选择性的允许分子量小于1500 Da的物质通过，对于维持线粒体内的电化学平衡和稳态有重要作用。当膜孔道开放，大量线粒体内容物释放，导致线粒体内外的跨膜电位降低或消失，氧化磷酸化解耦联，ROS产生增加，ATP生成减少，最终释放细胞色素C，活化凋亡蛋白酶激活因子，导致细胞死亡。在HFD诱导的NAFLD大鼠模型中，在高脂喂食4～12周开始，MPTP逐渐开放，Bax升高，Bcl-2/Bax比例下降，线粒体损伤，最终导致细胞凋亡[59]。由葡萄糖波动导致的NAFLD加重过程中，通过MPTP开放抑制剂可以预防线粒体损伤，抑制氧化应激，减少细胞凋亡[60]。

8 展望

虽然NAFLD正以前所未有的趋势席卷而来，但迄今肝病医生和科学家对该病的发病机制依然了解不够。虽然，NAFLD可以简单地理解为肝细胞脂质过度堆积所致，但如何防止脂质多度堆积，科学界还缺乏有效对策。虽然，人们逐步认识到NAFLD与线粒体“怠工”关系密切，但如何增加线粒体脂肪酸氧化效率，人们正在苦苦地寻找所谓“助燃剂”。虽然不少“制药巨头”纷纷投入巨资，一大堆所谓抗NAFLD的研发药物已经摆在pipeline上，但哪一个能“祛脂扶正”，真正成为未来治疗脂肪肝的“良丹妙药”，人们正拭目以待。可以推测，随着学界对NAFLD是一种“线粒体病”的认识不断取得共识，围绕有效促进脂质过氧化，抑制活性氧生成，维持线粒体稳态，保护线粒体等层面，展开深入研究，或许才能走上战胜NAFLD的一条“康庄大道”。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：肖卫纯起草文章内容；安威提供思路与框架，修改并校对文章。