微阵列酶联免疫技术检测糖尿病自身抗体的临床应用

吴行贵 肖倩 李沫 张轩 陈茶

作者单位：510120 广东广州，广东省中医院检验医学部，广州中医药大学第二附属医院检验医学部

糖尿病是以高血糖为特征、以糖代谢紊乱为主要临床表现的慢性内分泌代谢性疾病。糖尿病自身抗体是糖尿病诊断分型的体液免疫标志物，尤其能从初诊2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）中甄别出缓慢进展的免疫介导成人糖尿病，并预测其将来对胰岛素治疗的需要［1］。常用的糖尿病自身抗体包括谷氨酸脱羧酶抗体（glutamate decarboxylase antibody，GADA）、锌转运体8抗体（Zinc transporter 8 antibody，ZnT8A）、胰岛细胞抗体（islet cell antibody，ICA）、胰岛素抗体（insulin antibody，IAA）、酪氨酸磷酸酶抗体（tyrosine phosphatase antibody，IA-2A）等。目前临床实验室常用的自身抗体检测方法包括放射免疫分析法、化学发光法、酶联免疫法和免疫印迹法等。本文旨在探讨微阵列酶联免疫技术（Array-enzyme linked immunosorbent assay，Array-ELISA）同时检测5种糖尿病自身抗体的临床应用价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象及分组 选择2020年6 —12月在广东省中医院就诊的120例糖尿病患者作为研究对象，其中72例1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）患者作为T1DM组，48例T2DM患者作为T2DM组；另外选择同期23名健康体检者作为正常对照组。糖尿病患者的诊断分类标准均符合1999年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）糖尿病诊断标准的指南要求。健康体检者排除心、脑、肝、肾等器官慢性疾病及内分泌疾病，无糖尿病病史、家族史以及其他自身免疫性疾病病史。

1.2检测方法 采用糖尿病自身抗体检测试剂盒（Array-ELISA，深圳市伯劳特生物制品有限公司）测定参考血清标本和临床血清标本中GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A与IAA 5种糖尿病自身抗体，同时采用糖尿病自身抗体谱检测试剂盒〔条带免疫印迹法（immunoblotting test，IBT），斯德润（北京）医疗诊断用品有限公司〕进行对比试验。

1.2.1Array-ELISA 使用样品稀释液将血清样本稀释26倍，取100 μL加入平衡至室温的微阵列蛋白芯片反应孔中，室温孵育60 min；弃去孔中液体，每孔加入300 μL洗涤液，静置60 s，重复洗涤2次；加入抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）酶结合物50 μL，室温孵育30 min；弃去孔中液体，加入300 μL洗涤液，静置60 s，重复洗涤2次；加入底物50 μL，室温孵育30 min；弃去孔中液体，将芯片放入生物芯片阅读仪，使用DM-5Abs程序进行扫描判读，计算检测结果，阳性指数（positive index，PI）≥1.0判定为阳性，PI＜1.0判定为阴性。

1.2.2IBT 对比试验严格按照试剂说明书操作。

1.3临床应用评价 采用IBT作为对比方法，以Array-ELISA作为试验方法，同步检测3组血清标本，计算5种抗体的阳性符合率、阴性符合率、总符合率、诊断符合率、Kappa值和P值。以总符合率大于95.00%为符合率可接受的标准，以Kappa值＞0.75、配对χ2检验P≥0.05为两种检验方法所得结果一致性较好的标准。根据检测结果统计敏感度和特异度，评价Array-ELISA的临床适用性。

1.4伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经广东省中医院伦理委员会审批（审批号：DF2020-069-01），所有检测均获得过受检者或家属的知情同意。

1.5统计学方法 釆用SPSS 22.0软件分析数据。采用Kappa检验和配对χ2检验分析两种方法的一致性，报道Kappa值和配对χ2检验所得P值。

2 结果

2.1一般资料 T1DM组、T2DM组和正常对照组的性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），有可比性。见表1。

表1 不同分型两组糖尿病患者和正常对照组的一般资料

2.2 一致性评价 采用Array-ELISA与IBT法同步检测5种抗体的总符合率均大于95.00%，Kappa值均大于0.75，配对χ2检验所得P值均大于0.05，两种检测方法具有高度的一致性。见表2～3。

表2 Array-ELISA与IBT检测5种自身抗体结果比较

表3 Array-ELISA与IBT检测5种自身抗体的结果一致性评价

2.3临床诊断效能评价 Array-ELISA检测3组血清的5种抗体，T1DM组5种抗体的阳性率均明显高于T2DM组和正常对照组（均P＜0.05），见表4。Array-ELISA联合检测5种抗体对T1DM的诊断敏感度为58.33%，特异度为97.18%，见表5。

表4 Array-ELISA检测各组5种自身抗体的阳性率比较

表5 采用Array-ELISA单独或同时检测5种自身抗体对T1DM的诊断效能

3 讨论

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性内分泌代谢性疾病。有研究表明，糖尿病自身抗体在疾病发生前即可被检测到，而且2种或2种以上抗体阳性的体检人群中有27%～40%在未来10年内会发展为糖尿病［2］。当T1DM患者的父母、子女、兄弟姐妹等一级亲属体内检出糖尿病自身抗体时，其T1DM发病风险明显增大［3］。有研究显示，糖尿病患者一级亲属体内存在2种抗体阳性者，3年内糖尿病发病率为39%，5年内为68%；体内存在3种抗体阳性者5年内发病率可高达100%［4］。国内一项多中心研究报告显示，缓慢进展的免疫介导成人糖尿病在我国的发病率为5.9%［5］。美国糖尿病协会指出这类患者占初诊T2DM的10%～15%，其胰岛β细胞功能衰减速度较快，可达T2DM患者的3倍［6］。因此，胰岛自身抗体检测对于糖尿病的早期诊断和分型有重要价值，可通过早期医学干预来降低糖尿病酮症酸中毒等并发症的发生风险。

目前临床上用于糖尿病诊断分型的自身抗体主要包括GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA 5种。谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）由同工酶GAD65和GAD67组成，其中抗GAD65抗体与糖尿病进展密切相关［7-8］。GADA早期出现会抑制GAD的作用，使抑制性神经递质生成受到阻碍，导致胰岛细胞功能受损［9］。由于GADA在患者体内存在的时间长，因此与其他抗体相比，其阳性检出率较高，与胰岛细胞损伤有较强的相关性［10］。糖尿病患者血清中检出IA-2A，提示患者体内存在胰岛β细胞的特异性自身免疫应答。IA-2A的诊断特异度高，但随着病程的进展，阳性率逐渐降低，提示IA-2A主要存在于疾病的早期阶段。ICA是一种能与胰岛细胞多种分子发生反应的多克隆自身抗体的统称，通过激活补体系统对胰岛细胞的细胞质产生细胞毒效应，促使细胞溶解、凋亡进而导致糖尿病［11］。ICA常见于青少年患者，随着病程的延长，其阳性率逐渐降低。标准化的糖尿病自身抗体可用于成人糖尿病的分类以及出生时具有遗传危险因素的儿童T1DM的前瞻性研究［12］。胰岛β细胞特异性锌转运体是含有6个跨膜结构域的多通道蛋白，可参与调控胰高血糖素和胰岛素的旁分泌。ZnT8A在T1DM新发病例和高风险人群（糖尿病患者一级亲属）中阳性率较高［13］。研究表明， ZnT8A阳性的青少年糖尿病患者血液pH值低于阴性患者，酮症酸中毒的风险更高［14］。IAA是与糖尿病诊断相关的混合抗体，可与胰岛细胞内多种抗原结合。IAA并非糖尿病的特异性抗体，在其他内分泌相关疾病（如胰岛素综合征和甲状腺疾病等）患者体内亦可检出。由于外来胰岛素对体内IAA水平存在干扰，因此建议在患者尚未使用胰岛素治疗时进行IAA检测。

临床上针对糖尿病自身抗体有多种检测方法，其中采用硫35放射性同位素标记的放射结合沉淀法的重复性好、线性范围宽，敏感度和特异度高，被视为胰岛自身抗体检测的参考方法［15］。然而由于该方法对实验条件要求高、操作步骤复杂、影响因素多，因此不适于在一般临床实验室开展。化学发光法用于检测自身抗体具有高敏感度、高特异度和自动化等优点，但1次只能检测1个抗体。IBT能同时检测多种糖尿病自身抗体，但重复性和均一性较差。Array-ELISA可进行高通量检测，能同时检测5种自身抗体，检测结果通过生物芯片阅读仪自动判读，可减少人为判读误差。本研究显示，Array-ELISA和IBT两种方法对5种自身抗体的诊断符合率均在95.00%以上，Kappa值均大于0.75，具有高度一致性，说明Array-ELISA适用于临床上检测糖尿病自身抗体。Array-ELISA对5种抗体同时检测T1DM的特异度高达97.18%，但敏感度仅为58.33%，低于胡纪文等［16］研究结果，可能与研究对象的遗传背景、年龄、病程等不同有关。

综上所述，糖尿病作为一种慢性代谢性疾病易引发多种并发症，如糖尿病肾病、冠心病等［17-18］。自身抗体对糖尿病的早期诊断分型具有重要意义。5种自身抗体联合检测有助于提高阳性检出率，降低临床漏诊、误诊概率。Array-ELISA操作简便，检测效率高，能有效辅助临床进行糖尿病诊断分型，具有一定的应用价值，适用于临床实验室开展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突