三黄连复方制剂治疗尼罗罗非鱼链球菌病的试验

周淑棉，卢燕婷，朱萌，梁万文，刘高玫，韦英益，胡庭俊

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西壮族自治区水产科学研究院，广西 南宁 530021）

无乳链球菌Streptococcus agalactiae 是链球菌病的主要病原，主要侵入机体肠道，破坏机体的免疫系统，在宿主血液内增殖，透过血-脑屏障侵入脑组织，导致罗非鱼呈现典型的临床症状和组织病理学变化[1]，近年来，在粤西地区的发病率高达70%，给罗非鱼养殖业造成了巨大的经济损失。目前，防控罗非鱼无乳链球菌病的有效途径是接种疫苗[2]，疫苗接种方式主要有腹腔注射、浸泡喷雾和口服等[3-5]。腹腔注射疫苗途径治疗效果最佳，无须穿越鱼体的黏膜屏障即可快速诱导机体启动获得性免疫反应，还可根据保护效果来优化抗原剂量，缺点是注射时操作烦琐，耗时耗力，还会对鱼产生应激反应。因此，抗生素防控罗非鱼链球菌病仍然是主流，但长期使用化学药物和抗生素不仅对环境造成污染，还会引起细菌的耐药性。

中草药是“绿色环保抗菌剂”。研究表明，含青蒿、苦楝、槟榔、辣廖和苦参的复方中草药显著降低了患小瓜虫病草鱼的死亡率[6]。给患肝胆综合征的草鱼投喂含有奶蓟果复合物、胡黄连、乙酰半胱氨酸、绿茶、五味子和姜黄素等中草药，起到了一定的治疗作用[7]。泼洒含有2～16 mg·L-1黄芩和麻黄等复方中草药制剂能提高患水霉菌锦鲤的免疫能力[8]。这些成功的实践经验为中药制剂的临床应用提供了实践依据。本试验通过给感染的吉富罗非鱼Oreochromis niloticus 饲喂不同剂量的三黄连复方制剂，观察中药制剂对感染鱼的治疗效率、免疫指标和肝脏生化指标的影响，可为中药制剂的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌与药物

无乳链球菌B（GX107）由广西水产科学研究院鱼病研究室提供，保存于广西大学药理实验室。三黄连复方制剂由广西大学药理实验室提取制备，100 mL 相当于原生药50 g，即0.5 g·mL-1。氟苯尼考购自广西北斗星动物保健品有限公司。

1.1.2 试验动物

吉富罗非鱼体质量为（41.7±8.6）g，由广西水产科学研究院国家级广西南宁罗非鱼良种场提供，试验前在研究所水族楼大缸内暂养7 d。试验期间，池水温28℃，24 h 不间断充氧。试验前随机取5 尾鱼，取脑组织进行细菌分离培养，确保试验鱼未感染细菌。

1.1.3 试剂

总超氧化物歧化酶（T-SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、淀粉酶、总蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、谷胱甘肽（GSH）和黄嘌呤氧化酶（XOD）试剂盒均为南京建成生物有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 饲料制备

取相应体积中药制剂提取物，用喷雾器均匀喷洒于罗非鱼膨化饲料表面，充分混匀。待药物被饲料充分吸收后于室温下阴干，用塑料袋分装及密封，保存于-20℃。

1.2.2 攻毒菌液的制备

试验用无乳链球菌提前接种于血平板上，37℃恒温箱中培养20～24 h。试验前使用PBS 缓冲液洗下平板上的菌落，根据比浊法调整菌液浓度至1.5×109CFU·mL-1备用。

1.2.3 试验分组与处理

将暂养的180 尾吉富罗非鱼随机分为空白对照组、感染不给药组、氟苯尼考对照组及低、中、高三黄连合剂组（30 mL·kg-1、60 mL·kg-1和120 mL·kg-1），每组30 尾。

试验第1 d，空白对照组腹腔注射0.2 mL 的PBS 缓冲液，其他组均腹腔注射0.2 mL 浓度为1.5×109CFU·mL-1的无乳链球菌液。空白对照组与感染不给药组均饲喂不加药的基础料，不同剂量给药组分别饲喂含相应剂量三黄连复方制剂添加饲料，氟苯尼考对照组饲喂0.05 g·kg-1的含药饲料。试验期间，早中晚各饲喂一次，连续7 d。观察感染无乳链球菌的罗非鱼的发病情况，及时清理死鱼，每天统计各实验组罗非鱼的死亡率，计算组方对吉富罗非鱼的有效率。有效率＝（存活数/感染数）×100%。

1.2.4 测定免疫、消化和生化指标

血清免疫学指标：试验结束时，每组随机选取10 尾鱼，尾静脉采血1 mL 左右，分离血清测定T-SOD、AKP 和LSZ 的活性。

生化学指标：准确称量所取罗非鱼经脏组织的重量，按重量（g）∶体积（mL）＝1∶9 的比例加入预冷PBS，制备10%肝脏组织匀浆，4℃，2 500～3 500 r·min-1离心20 min，按照各试剂盒的说明书取上清液测定肝脏总蛋白、肝脏淀粉酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、谷胱甘肽（GSH）和黄嘌呤氧化酶（XOD）等的活性。

1.2.5 数据处理

试验数据以平均值±标准差形式表示，用SPSS17.0 统计软件进行单因素方差分析。P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著，P＞0.05 为差异不显著。有效率等计数资料采用χ2检验。

2 结果与分析

2.1 攻毒后罗非鱼的临床症状

攻毒后，感染吉富罗非鱼食欲废绝，行动迟缓，离群独游于水面，有时作旋转游泳后再沉于水底。攻毒后的罗非鱼体色发黑，眼球浑浊，突出，鳃部和胸鳍发红，肛门红肿。解剖发现病鱼脑组织水肿、出血，腹腔有黄色胶冻样积液，肝脏出现灰白色岛屿状的坏死斑，肠道糜烂。

2.2 有效率统计分析

由表1 可知，经三黄连制剂处理的感染鱼死亡率降低；与空白对照组比较，感染不给药组罗非鱼死亡率显著升高（P＜0.01）；低、中、高剂量的三黄连复方制剂对罗非鱼链球菌病治疗的有效率分别为50.00%、43.33%和60.00%。

表1 三黄连复方制剂对罗非鱼链球菌病的有效率Tab.1 The effective rates of Sanhuanglian compound preparation against tilapia streptococcosis

2.3 淀粉酶活性测定

人工感染无乳链球菌7 d 后，病原体对吉富罗非鱼机体的消化系统产生了一定的影响，与空白组比较，接种无乳链球菌试验鱼淀粉酶活性显著下调（P＜0.05）；与感染不给药组比较，中、高剂量的三黄连复方制剂组罗非鱼淀粉酶活性显著升高（P＜0.05），呈一定的剂量效率关系（表2）。

表2 试验鱼淀粉酶测定结果Tab.2 The amylase activities in the tilapia

2.4 血清免疫学指标及肝生化指标活性测定

由表3 可知，与空白对照比较，人工感染无乳链球菌7 d，感染不给药组罗非鱼血清中免疫因子AST 和AKP 的活性显著升高（P＜0.05），而LSZ 和ALT 的活性显著降低（P＜0.05）。与感染不给药组对比，低、中、高剂量的三黄连制剂显著升高了T-SOD的活性（P＜0.05），高剂量的三黄连制剂显著升高了AKP 的活性；中剂量三黄连制剂显著升高了LSZ 的活性（P＜0.05）；中、高剂量的三黄连制剂显著升高了ALT 的活性（P＜0.05）；低剂量的三黄连制剂显著升高了AST 的活性，中、高剂量的三黄连制剂显著降低了AST 的活性（P＜0.05）。

表3 试验鱼血清免疫因子及肝生化指标测定结果Tab.3 The results of the immune index and liver biochemical index of infected fish

2.5 吉富罗非鱼肝脏生化指标测定

由表4 可知，与空白对照组比较，在人工感染无乳链球菌7 d 后，下调了罗非鱼肝脏中的GSH-Px 的活性（P＞0.05）。与感染不给药组比较，不同剂量三黄连复方制剂上调了罗非鱼肝脏中GSH-Px 和GSH 的活性，下调XOD 的活性。中、高剂量三黄连复方制剂显著上调病鱼肝脏中的GSH活性（P＜0.05），低、中、高剂量三黄连复方制剂显著降低了病鱼肝脏XOD 活性（P＜0.05）。

表4 试验鱼GSH-PX、GSH 和XOD 活性分析Tab.4 Activities of GSH-PX,GSH and XOD in the tilapia

3 讨论

链球菌病是造成水产养殖业巨大损失的主要因素之一，病原已经由海豚链球菌Streptococcus iniae 转变为无乳链球菌，发病率为20%～30%，死亡率高达80%以上，目前，疫苗和免疫增强剂开发尚未取得完全的成功，中草药混饲给药不失为控制疾病最直接、简便的方法。

Rattanachaikunsopon 等[9]在饲料中添加穿心莲干叶粉末和穿心莲水提物有效降低了尼罗罗非鱼感染无乳链球菌的死亡率。李一珊等[10]发现，黄连醇提物影响无乳链球菌调整期的某个过程，抑制了细菌DNA 的合成，阻止了病原菌大量增长，可治疗罗非鱼无乳链球菌病急症和重症。三黄散和黄芪多糖通过清除病鱼机体内积累的毒素，修复受损的肝脏等器官，提高机体的免疫力，降低了罗非鱼链球菌病的死亡率[11]。黄芩苷可增强溶菌酶活性，提高杀灭金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的作用[12]。复方中草药添加剂对黄鳝Monopterus albus和虾等动物具有一定的生长促进作用[13,14]。本实验中，感染无乳链球菌后，罗非鱼死亡率达到66.67%，经不同剂量三黄连中药制剂治疗病鱼后，死亡率显著降低，对疾病的保护率提高。

三黄连复方制剂能在一定程度上提高病鱼的淀粉酶活性，增强病鱼的食欲，促进消化功能的恢复，这与王吉桥等[15]通过复方中草药提高患有淋巴囊肿的牙鲆幼鱼的淀粉酶活性的研究结果相类似。三黄连制剂处理病鱼后，肝脏GSH-Px 和GSH 活性增强，抑制了XOD 活性，降低氧自由基对肝脏的损伤，达到保护与修复肝脏的作用，其原因可能是中药制剂中含黄芩苷、黄芩素[16]、大黄素[17]和土连翘[18]等物质具有清除氧自由基、烷过氧自由基，抑制XOD 与XOD 具有较强的竞争性抑制等作用有关。

AKP 通过改变细菌表面的结构增强其异己性，利于动物吞噬细胞吞噬和降解细菌[19,20]。本试验中，罗非鱼受到链球菌的胁迫，病鱼体内AKP 的活性升高，饲喂三黄连复方制剂能进一步提高罗非鱼体内的AKP 的活性，增强罗非鱼清除病原体的能力。血浆中GPT 与GOT 水平是指示肝脏损伤的主要敏感指标。在正常生理情况下，GPT 与GOT 在血清中含量很低，但是，当细胞膜通透性增加或细胞坏死时会大量进入血液。罗非鱼链球菌爆发常伴随着肝脏损伤，大量的GPT 释放进血液，肝脏受损无法恢复至正常水平，导致肝脏GPT 含量显著下降[21,22]。

结论

罗非鱼腹腔注射浓度为1.5×109CFU·mL-1的菌液0.2 mL 后，诱导发生链球菌病，显著增加了罗非鱼的死亡率。不同剂量的三黄连复方制剂处理后，罗非鱼有效率均高于感染不给药组；且促进脾脏的发育，增强机体的免疫功能，显著升高病鱼血清T-SOD 和AKP 的活性；三黄连复方制剂能在一定程度上提高病鱼的淀粉酶活性，增强病鱼的食欲，促进消化功能的恢复；诱导肝脏增强GSH-Px和GSH 活性，降低XOD 活性，降低氧自由基对肝脏的损伤，保护与修复肝脏。