基于Smad通路研究软肝丸对TGF－β1诱导的肝星状细胞的影响*

2021-07-23吕莹郝尧坤张照兰

河南中医 2021年7期

吕莹，郝尧坤，张照兰

河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000

肝纤维化是由慢性肝损伤引起的病理状态。慢性肝炎、胆汁淤积、酒精或药物刺激均可引起肝损伤，并进一步激活肝损伤修复过程，引起肝纤维化，进而可发展为肝硬化，最终诱发肝癌发生［1－2］。软肝丸是鳖甲、龟板、穿山甲、当归、生牡蛎、桃仁、鸡内金、甘草等组成的复方制剂。研究表明，软肝丸可有效地促进肝纤维化逆转、改善门脉高压进而延缓肝硬化发展［3］。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肝纤维化进展的关键因素，肝损伤可诱导HSCs增殖、活化并分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）［4］。转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）是活化的HSCs分泌的成纤维细胞因子，其可诱导HSCs分化为成肌纤维细胞促进肝纤维化形成［5］。研究发现，软肝颗粒对肝纤维化大鼠TGF－β1／Smads通路具有调控作用［6］，但作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究通过体外细胞实验探讨软肝丸含药血清对TGF－β1诱导人HSCs LX－2增殖、凋亡、纤维化及Smad通路相关蛋白表达的影响，进一步揭示其抗肝纤维化的潜在分子机制。

1 材料

1.1 动物与细胞SD雄性大鼠，体质量（260±20）g，购于上海凯学生物科技有限公司，合格证号：SYXK（沪）2015－0016。人HSCs系LX－2购于武汉普诺赛生命科技公司。

1.2 药物与试剂软肝丸由鳖甲、龟板、穿山甲、当归、生牡蛎、桃仁、鸡内金、甘草等组成，批号：豫药制字Z20120712（郑），专利号：ZL201310443782.1）。TGF－β1（美国Sigma公司，货号：GF346）；细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK－8）、膜联蛋白V（Annexin V）－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染法凋亡检测试剂盒（北京索莱宝生化公司，货号分别为：CA1210、CA1020－20）；TUNEL试剂盒（美国Roche公司，货号：11684817910）；总RNA快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM（大连Takara公司，货号分别为：9108／9109、RR047A、DRR820A）；兔源Ⅰ型胶原（collagenⅠ，Col－Ⅰ）、兔源Col－Ⅲ、兔源结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、兔源纤连蛋白（fibronectin，FN）、兔源α平滑肌肌动蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、兔源β－肌动蛋白（β－actin）、羊抗兔IgG二抗抗体（上海艾博抗生物公司，货号分别为：ab34710、ab7778、ab227180、ab2413、ab5694、ab8227、ab205718）。

1.3 仪器ELx80型酶标仪（美国BioTek公司）；ckx53ipc型荧光显微镜（日本Olympus公司）；7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

2 方法

2.1 软肝丸含药血清制备将20只大鼠随机分为4组，即对照组及低、中、高浓度软肝丸（4.25 g·kg－1、8.5 g·kg－1、17 g·kg－1）组大鼠给予相应药物，对照组给予同体积生理盐水，连续给药3 d，末次灌胃1 h后，腹主动脉取血。1 500 r·min－1离心15 min，将同组血清混匀，56℃水浴30 min，孔径为0.22μm过滤器过滤除菌，分装后－20℃保存备用［7］。

2.2 细胞分组和细胞培养LX－2细胞采用高糖杜尔伯格伊戈尔培养基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）在37℃、含5%CO2的培养箱中培养，培养液中补充10%的胎牛血清。当细胞基本融合为一层时进行消化和传代，选择对数生长期细胞进行实验。空白组：用80%DMEM培养基＋20%对照血清；TGF－β1组：用含10μg·L－1TGF－β1［8］＋80%DMEM培养基＋20%对照血清；低浓度含药血清组：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培养基＋20%低浓度软肝丸含药血清（0.17μg·L－1）；中浓度含药血清组：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培养基＋20%中浓度软肝丸含药血清（0.34μg·L－1）；高浓度含药血清组：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培养基＋20%高浓度软肝丸含药血清（0.68μg·L－1），每孔重复3次。共培养24 h。

2.3 CCK－8法检测细胞活力每组取3×103个细胞加入96孔板，孵育24、48、72 h后，每孔加入10μL的CCK－8试剂，培养箱继续孵育2 h，每孔重复3次，用酶标仪检测各孔450 nm处光密度（optical density，OD）值。

2.4 流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡根据2.2培养细胞，分别用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。TUNEL法：将培养的细胞制片，40 ng·L－1多聚甲醛和体积分数80%乙醇固定后用磷酸盐缓冲液洗片3次。吸水纸吸干玻片上水分，滴加反应液37℃孵育1 h。终止反应后进行TUNEL反应混合液标记，再次洗涤后进行酶标反应和染色，荧光显微镜下观察细胞染色情况。凋亡细胞显示出黄绿色荧光，蓝色荧光为核染色。

凋亡指数（%）＝凋亡细胞个数／总细胞个数×100%

流式细胞术法：将各组细胞制备5×104mL－1的细胞悬液，取100μL细胞悬液加入流式管，按照Annexin V－FITC／PI试剂盒分别加入5μL的Annexin V－FITC和PI。避光反应10 min后补加400μL的结合缓冲液上机检测细胞凋亡情况。

2.5 RT－qPCR法检测Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN以及α－SMA mRNA表达将2.2培养的细胞，用总RNA快速提取试剂盒提取各组细胞总RNA，使用逆转录试剂盒合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），采用SYBR®PremixExTaqTMII进行RT－qPCR。反应体系为包含2×SYBR Premix ExTaqTM10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，50×ROX ReferenceDye 4μL，cDNA模板2μL，补加灭菌蒸馏水至总体为20μL。反应条件95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火／延伸35 s，共40个循环。2－ΔΔCt法分析mRNA表达量。引物序列（5′－3′）如下：内参β－actin上游GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，下游GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG；Col－Ⅰ上游TCAGGGGCGAAGGCAACAGT，下游TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA；Col－Ⅲ上游CGTCCTGCAGGTAACAGTGGTTC，下游TGCTCCAGTTAGCCCTGCAA；α－SMA上游CTAAGGCCAACCGGGAGAAA，下游CCAGAGTCCAGCACAATACCA；CTGF上游TCACTGACCTGCCTGTAG，下游GCTGAGTCTGCTGTTCTG；FN上游CATTCAACAAG AAACCACT，下游TCTGTCACTTCCACAAACT。

2.6 Western blot法检测Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN、α－SMA及Smad通路相关蛋白表达将2.2培养细胞，放射免疫沉淀试验（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）法获得细胞总蛋白，等量蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移到硝酸纤维素膜上。膜封闭后，室温下加入特异性一抗溶液孵育膜2 h，再加入酶标二抗孵育膜1 h，增强型化学发光显色试剂显影。Image J软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白和内参β－actin比值表示对应蛋白表达量。

2.7 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析和SNK－q检验分析多组间差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞增殖的影响与空白组比较，TGF－β1组肝星状细胞活力明显升高（P＜0.05）；与TGF－β1组比较，低、中、高浓度含药血清组肝星状细胞活力明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 软肝丸含药血清抑制TGF－β1诱导肝星状细胞增殖（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

3.2 软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞凋亡的影响与空白组比较，模型组肝星状细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，软肝丸低、中、高浓度肝星状细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。见图1、表2。

表2 软肝丸含药血清促进TGF－β1诱导肝星状细胞凋亡（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

图1 检测软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞凋亡的影响

3.3 软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA的影响与空白组比较，模型组肝星状细胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，软肝丸低、中、高浓度组肝星状细胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA水平均明显降低（P＜0.05）。见表3。

表3 软肝丸含药血清抑制TGF－β1诱导肝星状细胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGF mRNA、FN mRNA及α－SMA mRNA水平（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

3.4 软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞Col－、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白的影响与空白组比较，模型组肝星状细胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表达均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，软肝丸低、中、高浓度组肝星状细胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN以及α－SMA蛋白表达均明显降低（P＜0.05）。见表4、图2。

表4 软肝丸含药血清抑制TGF－β1诱导肝星状细胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表达（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

图2 肝星状细胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表达图

3.5 软肝丸含药血清对TGF－β1诱导肝星状细胞Smad通路蛋白的影响与空白组比较，模型组肝星状细胞p－Smad2／3蛋白表达明显升高，Smad7蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，软肝丸低、中、高浓度组肝星状细胞p－Smad2／3蛋白表达显著降低，Smad7蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见表5、图3。

图3 肝星状细胞Smad2／3、p－Smad2／3和Smad7蛋白表达

表5 软肝丸含药血清抑制TGF－β1诱导肝星状细胞p－Smad2／3蛋白和促进Smad7蛋白表达（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

4 讨论

HSCs在肝纤维化发病机制中起核心作用，肝损伤可诱导HSCs从静止状态转化为激活状态，HSCs通过分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）组织抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）抑制MMP活性，引起ECM积聚并产生白细胞介素6（interleukin 6，IL－6）、IL－8等促炎性细胞因子及TGF－β等促纤维化因子进一步激活HSC，促进分化为成肌纤维细胞并迁移至损伤部位合成Col－Ⅰ、α－SMA促进肝纤维化形成［9－10］。本研究中TGF－β1显著诱导LX－2细胞增殖及HSCs活化标志物α－SMA表达，抑制细胞凋亡，并促进Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN等纤维化标志物产生，这与杨淑娟等［11］的检测结果一致，提示LX－2细胞体外纤维化模型构建成功。

药理研究表明，鳖甲可改善肝炎、肝硬化患者临床症状，延缓病情的发展；龟甲具有免疫增强和抗氧化作用［12－13］。穿山甲具有降低血液黏度、抗炎、抗癌、消痈及镇痛的作用［14］。当归具有抑制血小板聚集、促进造血功能［15］。牡蛎可保护肝细胞膜免受脂质过氧化损伤，抑制肝细胞凋亡［16］。桃仁提取物通过促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原降解进而具有抗肝纤维化作用［17］。鸡内金可调节消化液分泌、提高消化酶活性，减少肝及肠系膜中脂肪堆积［18］。软肝丸全方配伍严谨，具有软坚散结、活血化瘀、益气养血功效，在临床用于治疗肝纤维化、肝硬化［19－20］。马素平等［21］研究显示，服用软肝丸可提高乙肝肝硬化患者人血白蛋白和胆碱酯酶水平、改善肝脏储备功能，并降低门脉高压症。本研究探讨软肝丸抗纤维化作用潜在机制发现，软肝丸含药血清可促进LX－2细胞凋亡，这与孟胜喜等［7］研究发现一致。此外，软肝丸含药血清明显阻止TGF－β1诱导的LX－2细胞增殖和活化。在正常肝脏中HSCs可通过调节ECM合成和降解可维持ECM沉积平衡，而HSCs过度激活将导致ECM大量沉积，最终导致肝组织结构破坏和功能障碍［22］。FN在胶原沉积中具有重要作用。CTGF是一种富含半胱氨酸的基质细胞蛋白参与细胞增殖、分化、黏附、血管生成及组织纤维化等生理病理过程，通过抑制CTGF表达可抑制HSCs表型转换进而缓解肝纤维化进展［23－24］。丹防胶囊通过降低肝组织中α－SMA、COL－Ⅰ、COL－Ⅲ蛋白表达，对大鼠肝纤维化有一定的保护作用［25］。与上述研究一致，本研究软肝丸含药血清可有效抑制TGFβ1诱导细胞中Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、FN和CTGF蛋白表达，提示软肝丸含药血清可抑制TGF－β1诱导后LX－2细胞纤维化。综上所述，软肝丸含药血清通过抑制LX－2细胞增殖、活化、ECM合成并诱导细胞凋亡进而发挥抗纤维化作用。

Smad蛋白是TGF－β1的关键细胞内效应因子，Smad2和Smad3具有促肝纤维化作用，而Smad7具有保护作用［26－27］。研究表明，丹酚酸B通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的Smad2／3磷酸化表现出显著的抗纤维化作用［28］。二氢杨梅素通过抑制Smad2／3磷酸化可抑制HSCs活化从而抑制ECM产生［29］。本研究软肝丸含药血清可显著降低TGF－β1诱导后p－Smad2／3表达，升高Smad7蛋白表达，提示软肝丸含药血清可能通过调控Smad信号通路影响LX－2细胞增殖、活化和凋亡而发挥抗纤维化作用。

综上所述，软肝丸可抑制TGF－β1诱导的肝星状细胞增殖、活化和纤维化，促进细胞凋亡，其机制可能与调控Smad通路有关。这丰富了软肝丸在肝纤维化中的保护作用，为其在预防或逆转肝纤维化应用奠定坚实基础。