血清miR-26b、miR-222表达与阿尔茨海默病患者认知功能损害的关系＊

林瑞典 张辉

阿尔茨海默病（Alzheimer disease）随着社会老龄化的进程发病率越来越高，严重危害人们的健康[1]。研究报道，miRNA在许多疾病中调节着神经细胞的增殖与分化等过程，对认知功能具有一定的影响[2]。大量研究表明，人体血清中有许多种miRNA的表达，当人体患有疾病时，miRNA表达存在差异显著，可以用作疾病早期诊断的潜在标记[3-4]。研究表明，miR-26b的上调可以诱导大鼠海马神经元凋亡[5]。目前，阿尔茨海默病患者血清中miR-26b和miR-222的表达特点还没有明确的结论，本研究分析了miR-26b、miR-222的表达水平及其与患者简明精神状态量表（MMSE）评分的关系，探讨其与阿尔茨海默病患者认知功能损害程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月-2019年12月本院收治的确诊阿尔茨海默病患者86例（观察组），同期进行健康体检的志愿者90例作为对照组。纳入标准：（1）阿尔茨海默病患者的诊断标准参考文献[6]美国国立神经病、语言疾病、卒中研究所与阿尔茨海默病及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）标准；（2）年龄≥60岁；（3）对照组为健康体检的志愿者。排除标准：（1）伴有恶性肿瘤；（2）因脑血管疾病引起的认知功能障碍；（3）伴有其他类型精神疾病（抑郁症、焦虑症等）；（4）既往具有颅脑外伤病史、颅脑手术病史。观察组年龄60～86岁，平均（72.2±5.6）岁；男48例，女38例。对照组，年龄60～85岁，平均（71.8±6.0）岁；男45例，女45例。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。患者知情同意，签署知情同意书。本研究符合医学伦理学相关规定（医学伦理委员会文件：院伦办[2017]9号）。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-26b、miR-222检测方法 荧光定量PCR检测miR-26b和miR-222的表达水平：使用RNA提取试剂盒（产品编号：DP443，购自北京天根生化有限公司）对患者总血清RNA进行提取，通过反转录获得cDNA。目的基因扩增：使用定量PCR仪器（型号：CFX96，购自美国Bio-Rad）对miR-26b和miR-222进行扩增。定量检测：设置qRTPCR反应系统总量为10 μl：其中有5 μl iScriptSYBR®Green Mix、1 μl DNA（浓度为 50 ng/μl），浓度为 10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μl，3.0 μl dH2O。反应条件：95 ℃，90 s；95 ℃，30 s；63 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 个周期。以 U6 作为内参，miR-26b和miR-222表达水平使用2-ΔΔCT方法来定量。

1.2.2 其他指标检测 检测两组患者的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。采集患者5 ml的空腹静脉血，在室温条件下以3 500 r/min的速度离心15 min，分离上层血清保存于EP管中，于-80 ℃冰箱中保存待测。TG、TC、LDL-C、HDL-C水平使用全自动生化分析仪进行测定；采用己糖激酶法测定FPG水平；所有样品均由检验部门中同一批人员在同一台仪器上进行测试，每个样品设置为重复3次。使用汞柱式标准袖带血压计测量血压，所有受试者静坐至少15 min，然后测量右上臂的血压。将Korotkoff的第1和第5音分别用作SBP和DBP的结果，进行3次连续测量，每次间隔2 min，测3次取平均读数。

简明精神状态量表（MMSE）评分：定向力（10分）、注意力和计算力（5分）、记忆力（3分）、回忆能力（3分）、语言能力（9分），总分为30分，MMSE得分≥27分为正常[7]。在安静环境中采用MMSE进行认知功能的评估。

1.3 统计学处理

统计分析采用SPSS 21.0软件，两组血清miR-26b、miR-222表达水平及MMSE评分等计量资料采用（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson线性相关分析法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受教育年限、血压、血脂、血糖指标比较

观察组和对照组的受教育年限、SBP、DBP、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组的受教育年限、血压、血脂、血糖指标比较 （±s）

表1 两组的受教育年限、血压、血脂、血糖指标比较 （±s）

LDL-C（mmol/L）观察组（n=86） 10.55±2.64 136.43±8.50 76.44±7.52 5.32±0.64 1.84±0.40 4.96±0.51 1.20±0.18 2.82±0.58对照组（n=90） 10.32±3.01 134.71±7.83 77.26±7.60 5.40±0.58 1.91±0.38 5.12±0.58 1.25±0.20 2.76±0.55 t值 0.538 1.397 -0.719 -0.870 -1.191 -1.940 -1.741 0.704 P值 0.591 0.164 0.473 0.386 0.235 0.054 0.084 0.482组别 受教育年限（年）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）FPG（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）

2.2 两组血清miR-26b、miR-222表达水平及MMSE评分比较

观察组的血清miR-26b、miR-222表达水平及MMSE评分低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组血清miR-26b、miR-222表达水平及MMSE评分比较（±s）

表2 两组血清miR-26b、miR-222表达水平及MMSE评分比较（±s）

组别 miR-26b miR-222 MMSE评分（分）观察组（n=86） 0.634±0.153 0.681±0.177 20.51±1.95对照组（n=90） 1.027±0.225 0.984±0.205 28.05±1.08 t值 -13.489 -10.474 -31.918 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 相关性分析

阿尔茨海默病患者的血清miR-26b、miR-222表达水平与MMSE评分均呈显著的正相关关系（P＜0.05），见表3。

表3 miR-26b、miR-222表达水平与MMSE评分线性相关分析

3 讨论

阿尔茨海默病是老年人经常发生的疾病，其发病机制仍不清楚。最近的研究表明，多种miRNA表达异常与人们心血管疾病、神经系统疾病及肿瘤等的发生有关[8-9]。有学者在阿尔茨海默病转基因小鼠模型中检测到了一些出现显著变化的miRNA，并且证实了miRNA能够影响淀粉样前体蛋白的表达，并进一步导致Aβ的沉积[10]。Aβ又能影响miRNA的表达，Aβ是miRNA水平发生失衡的始动因子。两者之间的这种关系会促进体内的相互影响，从而影响阿尔茨海默病的进展[11]。

已有研究显示miRNA-222可通过靶向抑制PPPLCA来提高tau蛋白的磷酸化水平[12]。据报道，miR-222与结直肠癌、甲状腺癌等有关[13]。有研究称，血管性痴呆患者血清中的HDL-C含量低于健康人，HDL-C可能与血管性痴呆的发生有关[14]。与HDL-C不同，低认知阿尔茨海默病患者血清中的LDL-C水平远高于健康者。

有研究者发现阿尔茨海默病患者血清miR-26b水平显著降低，提示其与阿尔茨海默病的发生相关[15]。本研究也得出相同的结论，表明miR-26b可能对患者的神经元损害有不利影响，影响其认知功能。分析的原因是在阿尔茨海默病患者的脑组织中淀粉样前β降解酶1（BACE1）的表达增加，导致相应的病理变化。该研究认为，miR-26b可以穿过靶基因BACE1的3’UTR区，并与BACE1表达的调控相结合，随后在APP水解导致阿尔茨海默病后增加Aβ的产生和沉积，并可能通过调节BACE1来参与疾病进程，miR-26b可能还诱导神经元细胞周期停滞和更新，在Aβ和神经元纤维缠结形成之前，就作用于细胞周期，影响细胞的生理过程，参与阿尔茨海默病的发生，具体机制还有待进一步的探讨。

阿尔茨海默病患者血清中miR-26b和miRNA-222的低表达可能充当阿尔茨海默病的潜在生物标志物，并可能成为治疗靶标。两者都与阿尔茨海默病的发病机制和发展及患者的认知功能有关。但是，本研究的样本量很小，未来的研究将扩大样本量，以便进一步研究miR-26b和miRNA-222是否可以用作诊断早期阿尔茨海默病标记和预测患者认知功能的基础指标。

综上所述，阿尔茨海默病患者的血清miR-26b、miR-222表达水平高于非阿尔茨海默病人群的平均水平，并且与患者认知功能障碍程度有一定的关系。