LncRNA HAND2-AS1检测对肿瘤诊断价值的Meta分析

胡尚尚，王媛媛，高 宇，3

(蚌埠医学院 1.检验学院；2.生命科学院；3.癌症转化医学安徽省重点实验室，安徽 蚌埠 233030)

国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)调查显示，2018年全球估计有1810万例新增肿瘤病例和960万死亡病例[1-2]。因恶性肿瘤的早期筛查没有普遍开展，故当发现患有恶性肿瘤时，大多数病人已处于晚期，且恶性肿瘤的病人普遍预后很差。因此开展肿瘤诊断标志物的筛选与鉴别对肿瘤患者的早期诊断十分重要[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一组大于200个碱基对的非编码RNA，在发育、遗传、干细胞生物学、癌症等方面已成为多种生物学过程的重要分子。LncRNA HAND2反义RNA 1(HAND2-AS1)在不同类型的癌症中表现出肿瘤抑制活性，如在结直肠癌中，HAND2-AS1可通过上调miR-1275介导的Kruppel样因子14(Kruppel like factor 14，KLF14)表达来抑制结直肠癌的进展[4]；在非小细胞肺癌中，HAND2-AS1可通过与TGF-β1的相互作用抑制细胞迁移和侵袭[5]。本文以血液中HAND2-AS1的表达水平在多种癌症中的临床诊断价值做一Meta分析，探索HAND2-AS1检测在多种肿瘤诊断方面的临床意义。

1 资料和方法

1.1 纳入和排除文献的标准纳入标准：(1)肿瘤患者必须经组织病理学检查确诊；(2)HAND2-AS1表达水平与肿瘤、癌症的发生发展的相关性研究；(3)研究设计必须为病例对照研究；(4)研究必须提供足够的资料以评估HAND2-AS1在肿瘤患者中的诊断价值；(5)全文以英文发表。排除标准：(1)会议、摘要、信件、综述、社论和病例报告；(2)重复出版物；(3)只进行细胞或动物实验；(4)研究的疾病不是关于肿瘤或者癌症方面的。

1.2 文献检索策略以“HAND2-AS1 and cancer”或“HAND2-AS1 and tumor”或“HAND2 antisense RNA 1 and cancer”或“HAND2 antisense RNA 1 and tumor”为关键词，在PubMed、Embase、SinoMed、CNKI和万方等数据库，检索时限为1980年1月1日至2020年9月30日，国内外公开发表有关HAND2-AS1表达水平与肿瘤癌症相关的所有文献。

1.3 数据提取两名评价员(胡尚尚，王媛媛)严格按照文献纳入与排除标准，独立对检索到的文献进行评估和筛选；如遇到分歧，则所有作者共同阅读该文献，进行纳入与否的判断。同时，作者还检查了所有相关文献的参考目录的文献，以避免因为检索词或者数据库收纳的原因造成的文献缺失。文献选定后，需提取以下数据：肿瘤/癌症类型、研究国别、实验组和对照组的例数、HAND2-AS1的检测方法及表达情况、文献发表时间、作者信息等。

1.4 文献质量评价根据诊断准确性研究的质量评价工具(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies，QUADAS)量表对纳入文献的质量进行评价，共参考11个条目，分为“是”、“否”、“不清楚”三个等级，回答“是”的加1分，回答“否”的减一分，回答“不清楚”的不加分。最后累计的分数为评判纳入文献的质量高低。0～6分为低质量文献，6～11分为高质量文献。

1.5 统计学分析采用STATA 14.0软件对数据进行Meta分析。采用I2检验和Cochrane’sQ检验分析研究间的异质性，如果P≤0.1及I2>50%，表明存在的异质性，可采用随机效应模型进行分析，反之，当P>0.1及I2<50%时，可采用固定效应模型或随机效应模型进行分析[6]。综合分析研究结果，对于诊断型Meta分析计算灵敏度(Sensitivity，SEN)、特异性(Specificity，SPE)、阳性似然比(Positive Likelihood Ratio，PLR)、阴性似然比(Negative Likelihood Ratio，NLR)和诊断比(Diagnostic Odds Ratio，DOR)。PLR值[敏感性/(1-特异性)]越大，真阳性的可能性越高，相反，NLR值(1-敏感度/特异度)越小，表示试验结果真阴性的可能性越高。DOR是疾病中阳性的几率与未患病的阳性几率的比值，DOR的值范围从0到无穷大，值越高表示区分测试性能越好。此外，还绘制了SROC，并采用Deek漏斗图对纳入的研究进行发表偏倚检验。另外采用费根图计算诊断后概率。对于连续型变量合并效应量为标准化均数差(Standardized Mean Difference，SMD)，采用Cohen分类评价总体效应大小，SMD<0.2，属于小效应；SMD在0.2～0.8之间，属于中等效应；SMD>0.8属于大效应[7]。并采用Begg’s检验，进行文献发表偏倚检验。

2 结果

2.1 文献检索流程及结果如图1所示，从PubMed、Embase、SinoMed、CNKI和万方等数据库检索到153篇文献，排除重复文献111篇，剩余文献42篇。通过对42篇文章进行题目和摘要分析后，排除以细胞或动物为实验对象研究的文献30篇，确定需要阅读全文的文献12篇。通过纳入和排除标准，最终6篇文献纳入此Meta分析研究中。具体的文献排除与纳入的流程见图1。

图1 文献纳入与排除流程

2.2 纳入文献的基本信息经过严格的纳入与排除标准，本研究共筛选出6篇相关文献，且均为英文文献。通过QUADAS评分，所有纳入的文献评分均符合纳入与排除标准。这6个研究涉及到6种不同类型的肿瘤或癌症，包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[5]、宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)[8]、骨肉瘤(osteosarcoma)[9]、三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)[10]、食管鳞状细胞癌(esophageal squamous‐cell carcinoma，ESCC)[11]、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[12]。累计317名肿瘤患者和227名健康对照者，采用RT-qPCR方法检测血液中HAND2-AS1的表达情况，见表1。

表1 纳入文献的基本信息(n)

2.3 异质性检验及偏倚检验

2.3.1 定量分析 对于连续型变量采用异质性检验，结果为I2=38.1%，P=0.152(图2)。该结果表明这些研究之间不存在异质性，因而选用固定效应模型对效应指标值进行合并。Begg's检验的结果为Z=1.5、P=0.153，表明无发表偏倚，倒置漏斗图如图3所示，经总体效应检验[SMD=-1.61，95%CI(-1.80，-1.41)，P<0.00001]，差异具有统计学意义。

图2 HAND2-AS1定量分析森林图

图3 HAND2-AS1定量分析倒置漏斗图

2.3.2 HAND2-AS1的诊断价值 如森林图所示(图4)，结果提示有显著的异质性(SEN：I2=91.13，SPE：I2=80.58)，因此选择随机效应模型对纳入对象的SEN、SPE、PLR、NLP、DOR合并分析。如图5 Deek漏斗图所示(t=-0.81，P=0.461)，未显示出发表偏倚。获得检测血液样品中HAND2-AS1的表达水平对多种肿瘤诊断价值的相关结果，SEN=0.87[95%CI(0.71，0.95)]，SPE=0.82[95%CI(0.71，0.90)]，PLR=4.9[95%CI(3.2，7.7)]，NLR=0.15[95%CI(0.07，0.35)]，DOR=32[95%CI(16，23)]。如图6所示，SROC曲线[AUC=0.91，95%CI(0.88，0.93)]，AUC面积最大值为1，面积越接近1提示检测对象的诊断价值越高。费根图对HAND2-AS1图分析显示(图7)，阳性结果的post-test概率从20%增加到55%，阴性结果减少到4%。

图4 HAND2-AS1对多种肿瘤诊断的SEN和SPE森林图

图5 Deek漏斗图

图6 综合受试者工作特征曲线

图7 HAND2-AS1对多种肿瘤诊断的费根图

3 讨论

肿瘤是威胁人类健康的常见疾病，早期诊断对肿瘤治疗至关重要[13]。近年来，对lncRNA的深入研究表明，lncRNA的表达水平在肿瘤细胞中被上调或下调，在肿瘤中充当癌基因或抑癌基因，lncRNA与肿瘤之间的关系已成为研究的热点[14-15]。多个研究表明lncRNAHAND2-AS1具有抑制肿瘤发生发展的作用，并在多种类型的肿瘤中表达降低。在Li等人的报道中，宫颈癌患者与正常人相比，宫颈癌患者lncRNA HAND2-AS1表达降低，并且其可通过下调Rho相关蛋白激酶1抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。Min等人的研究中，三阴性乳腺癌患者与健康对照组相比，TNBC患者的lncRNAHAND2-AS1血浆水平显著降低并能通过下调RUNX家族转录因子2抑制癌细胞的增殖而成为TNBC中的抑癌基因[10]。这些研究表明lncRNAHAND2-AS1作为抑癌基因在多种类型的肿瘤中起到抑制肿瘤发生发展的作用。综上，lncRNAHAND2-AS1可作为多种肿瘤的潜在治疗靶点和诊断标志物。

本次Meta分析中，通过定量评价和诊断分析，评估血液中HAND2-AS1对多种肿瘤的诊断价值。上述连续型变量分析中，合并效应量SMD=-1.61，95%CI(-1.80，-1.41)，通过分析森林图，我们发现其95%CI横线不与无效竖线相交，且该横线落在无效线左侧，说明血液HAND2-AS1表达水平与肿瘤的发生率存在负相关，提示血液HAND2-AS1表达降低与患癌症的风险增加存在显著的效应。随后我们继续对血液中HAND2-AS1的表达进行诊断分析，敏感度和特异度分别为87%和82%，在诊断多种癌症中具有较高的准确性。此外PLR=4.9、NLR=0.15，表明HAND2-AS1对肿瘤诊断为阳性的可能性是错误诊断为阳性的可能性的4.9和对肿瘤错误诊断为阴性的可能性是正确诊断为阴性可能性的0.15倍。重要的是DOR=32和绘制的SROC曲线AUC=0.91，表明HAND2-AS1对区分肿瘤有很高的准确率；另外，费根图图显示，HAND2-AS1可使肿瘤诊断准确率提高35%，从上述结果可以看出，血液中HAND2-AS1的表达对多种肿瘤的诊断有很高的准确性。

综上所述，血液中HAND2-AS1的表达可作为多种肿瘤诊断的潜在标志物。但本次研究也存在一定局限性，首先在诊断分析中有显著的异质性。异质性是影响此次研究的主要因素，我们通过严格的纳入和排除筛选，也无法降低异质性。异质性的来源有很多方面，如研究的样本来自不同的总体、研究的样本量过少、研究实施的环境差异等，均是产生异质性的主要来源。其次本次研究对象只有中国人，这意味着我们的结果只适用于中国人，而且一些用于恶性肿瘤预测和诊断模型还未建立完善，相应的分子机制仍有待充分阐明。

总之，异常的lncRNA表达谱可作为一种新的生物标志物来区分肿瘤患者和健康个体，当前研究的数据有助于了解血液中HAND2-AS1的表达在多种肿瘤诊断中的价值。