高效液相色谱法同时测定叶氏消渴方降糖颗粒中6种成分

杨力龙，龚志强，霍 宇*，梁天坚，汪 磊，李思梅，刘方蓉

(1.广西中医药大学附属第一医院，中国 南宁 530023；2.广西中医药大学赛恩斯新医药学院 ，中国 南宁 530222)

叶氏消渴方为《临证指南医案》卷六“三消”中治中上焦消渴病的首方[1-7]，疗效显著。方中取生地为君药，甘寒质润，清热凉血，养阴生津，配合滋阴泻火、润燥除烦的知母、石膏为臣药，再辅以生甘草、麦冬以清热解毒、补液生津，生白芍为使药，养血敛阴，柔肝止痛，引散血中郁热[8-10]。药理实验结果表明，运用现代的中药药剂学理论和方法制备成的叶氏消渴方降糖颗粒剂，通过无糖化的制剂辅料设计，在保障其药效的同时，有效解决了中药煎煮麻烦、携带不便、量大难喝等弊端[11]。在已有最优叶氏消渴方药量配伍的基础上[12]，本实验采用高效液相色谱法分别搭载二极管阵列检测器(HPLC-DAD)及蒸发光检测器(HPLC-ELSD)对叶氏消渴方降糖颗粒剂中主要的6种成分进行含量测定，为叶氏消渴方降糖颗粒剂的质量评价提供参考。

1 仪器和试药

1.1 实验材料

各标准品没食子酸(批号：110831-201605)、梓醇(批号：110808-201711)、芍药苷(批号：110736-201844)、丹皮酚(批号：110877-201805)、知母皂苷B Ⅱ(批号：111839-201706)，均购自中国食品药品检定研究院。麦冬皂苷D对照品(批号：A0037-201812)，购自成都曼思特生物科技有限公司；叶氏消渴方降糖颗粒剂7批样品为实验室自制(批号：181001，181002，181003，181004，181005，181006和181007)，原药材产地见表1，均由广西中医药大学赛恩斯新医药学院黄茂春副教授鉴定；常用试剂为AR分析纯，娃哈哈纯净水，色谱乙腈(批号：19012101，美国TEDA)；色谱甲醇(批号：19011312，美国TEDA)。

表1 叶氏消渴方降糖颗粒剂生药来源

1.2 实验仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，1200化学工作站，二极管阵列(DAD)检测器；Allteach 3300蒸发光散射(ELSD)检测器(成都奥泰万谱科技)；KM-615D超声波清洗器(广州科洁)；XS205DU型电子分析天平(上海Mettler Toledo)；SG-4054恒温水浴锅 (上海硕光)。

2 实验方法与结果

2.1 HPLC法同时测定叶氏消渴方降糖颗粒剂中梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱选用岛津Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流动相为0.5%磷酸水溶液-乙腈(体积比92∶8)等度洗脱；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：210 nm。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定叶氏消渴方降糖颗粒剂，约5 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇水溶液50 mL，超声提取30 min(功率200 W，超声频率50 kHz)，冷却摇匀，过滤，滤液经60 ℃水浴挥干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，定容，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即制备得供试品溶液。

2.1.3 混合对照品的制备 分别精密称取对照品梓醇12.68 mg，没食子酸17.8 mg，芍药苷15.64 mg，丹皮酚14.26 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即分别得到0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合对照品储备液。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚质量浓度分别为0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合对照品储备液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.1.1”色谱条件下进样10 μL，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，计算线性回归方程，结果见表2。

表2 叶氏消渴方降糖颗粒剂中4种成分的线性关系考察结果

2.1.5 精密度考察 取梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚质量浓度分别为0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合对照品储备液，按“2.1.1”色谱条件连续进样测定6次，计算各组分平均峰面积和RSD值。结果梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚平均峰面积分别为863.8，480.1，270.7和313.9；4种成分RSD值分别为0.96%，1.08%，1.16%和1.27%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称定181002批次叶氏消渴方降糖颗粒剂6份，按“2.1.2”方法平行制备供试品溶液，按“2.1.1”方法测定，结果梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚的平均含量分别为0.147 8，0.227 4，0.131 2，0.082 6 mg·g-1；RSD值分别为2.17%，1.83%，1.98%和1.63%，可见方法重复性良好。

2.1.7 稳定性考察 取181002批次叶氏消渴方降糖颗粒剂供试品溶液，在同一色谱条件下于0，2，4，6，8，12 h进样测定峰面积，结果梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚峰面积的RSD值分别为1.04%，1.61%，2.12%和1.57%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.8 专属性试验 精密称取缺生地、白芍药材制备的阴性样品5 g，按“2.1.2”方法制备，得缺生地、白芍的阴性供试品，分别吸取各样品，按上述“2.1.1”色谱条件下进行测定，结果阴性样品液沒有色谱峰干扰，提示此法专属性良好，结果见图1。

图1 样品专属性考察HPLC图谱(A：混合对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性供试品溶液)

2.1.9 加样回收考察 取181002批次叶氏消渴方降糖颗粒剂供试品溶液9份，每份约5.0 g，等量加入已知浓度的混合对照品溶液2.0，3.0，4.0 mL，按“2.1.2”方法制备，按“2.1.1”方法计算加样回收率，结果梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚平均加样回收率分别为 98.51%，98.86%，98.24%和98.28%，平均RSD值为0.71%，0.63%，0.99%和0.74%。实验结果见表3。

表3 加样回收率实验结果(n=9)

2.1.10 样品测定 精密称取叶氏消渴方降糖颗粒剂每批次各3份，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，用“2.1.1”方法测定，分别计算梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚的含量。

2.2 HPLC-ELSD法测定叶氏消渴方降糖颗粒剂中知母皂苷、麦冬皂苷D含量

2.2.1 色谱条件 默克Lichrospher 5HE C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(体积比25∶75)等度洗脱，柱温30 ℃，流速设置为1.0 mL·min-1；蒸发光检测器：漂移管温度80 ℃，气体流量2.0 L·min-1，增益为8；以知母皂苷B Ⅱ计算，理论塔板数不低于3 000。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定叶氏消渴方降糖颗粒剂10 g，置具塞锥形瓶中，精密加入3倍体积30%的丙酮溶液，超声30 min(超声功率 400 W，频率60 kHz)，冷却，过滤，取续滤液于50 ℃水浴挥干，甲醇溶解并定容，摇匀后过0.25 μm微孔滤膜，即制备得供试品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称定知母皂苷B Ⅱ 11.28 mg，麦冬皂苷D 9.96 mg，共同置于25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解并定容，摇匀，过0.25 μm微孔滤膜，即得浓度分别为0.451 2，0.398 4 g·L-1的混合对照品储备液。

2.2.4 标准曲线的制备 精密吸取质量浓度分别为0.451 2，0.398 4 g·L-1的知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D混合对照品溶液适量，加甲醇稀释，定容至适当比例，按“2.2.1”方法测定，纵坐标(Y)为对照品峰面积的自然对数值，横坐标(X)为对照品的进样量(μg)，绘制标准曲线，结果表明知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D进样量分别在0.451 2～4.512 μg和0.398 4～3.984 μg时线性关系良好，回归方程为Y=1.503 2X+6.031 1(r=0.999 3)；Y=1.227 5X+3.797 9(r=0.999 4)。

2.2.5 精密度实验考察 精密吸取质量浓度分别为0.451 2，0.398 4 g·L-1的知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D混合对照品溶液适量，按“2.2.1”方法连续进样6次，测得知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D的峰面积自然对数RSD值分别为1.83%和2.02%，表明精密度良好。

2.2.6 重复性实验考察 取181002批次叶氏消渴方降糖颗粒剂6份，精密称定，按“2.2.2”方法平行制备6份供试品溶液，照“2.2.1”方法进样，测得知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D的平均含量分别为52.14，37.07 μg·g-1，RSD值分别为2.03%和1.93%，说明方法重复性较好。

2.2.7 稳定性实验考察 精密吸取181002批次叶氏消渴方降糖颗粒剂供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h进样测定，结果知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D峰面积自然对数RSD值分别为1.13%及2.26%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.8 专属性试验 取缺知母、麦冬药材的的阴性样品10 g，按照“2.2.2”方法制备阴性供试品溶液，分别吸取对照品、样品及阴性供试品溶液，按照“2.2.1”色谱条件进行测定，结果阴性样品无色谱峰干扰，表明上述方法专属性良好，见图2。

图2 样品HPLC-ELSD专属性色谱图(A.知母皂苷B Ⅱ对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性供试品溶液)

2.2.9 加样回收实验考察 精密称定叶氏消渴方降糖颗粒剂(批号：181002)，共9份，每份约10 g。等量加入已知浓度的混合对照品溶液2.0，3.0，4.0 mL， 按“2.2.2”方法制备，按“2.2.1”计算加样回收率，结果知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D的加样回收率分别为98.51%和99.51%，平均RSD值分别为 0.59%及1.85%，结果见表4。

表4 加样回收率实验结果(n=9)

2.2.10 样品测定 精密称定各批次叶氏消渴方降糖颗粒剂3份，每份10 g，按“2.2.2”方法制备，依照“2.2.1”方法进样测定峰面积，计算样品中知母皂苷B Ⅱ、麦冬皂苷D的含量，综合“2.1.10”测定结果，自制的7批次叶氏消渴方降糖颗粒剂样品中各成分含量测定结果见表5。

表5 不同批次叶氏消渴方降糖颗粒剂主要成分含量测定结果(n=3)

3 讨论

叶氏消渴方组方均为常见中药，现代中药药理研究表明方中大多数中药具有多靶点、多环节降血糖的作用[13]。生地黄作为中医降血糖“圣药”，可富集梓醇[14，15]。体内体外动物实验结果表明，梓醇能明显降低实验动物的血糖，调节实验动物的血脂平衡，可作为生地降血糖的代表性活性物质。知母在有效降低实验动物血糖的同时，对糖尿病并发的神经损伤具有保护作用。研究表明知母的主要降血糖活性物质包括知母多糖、知母醇提物、单体提取物OfficinalisininⅠ等[16-18]，其中知母皂苷B Ⅱ广泛用于心血管疾病、降血糖和免疫调节等方面[19，20]，可作为知母的主要有效活性成分。麦冬作为临床常用的滋补类中药，其中麦冬皂苷D具有显著的降血脂、降血糖、诱导细胞凋亡等作用[21，22]。本文选取生地的主要降糖活性成分梓醇，白芍中的主要活性成分没食子酸、芍药苷、丹皮酚，知母中的知母皂苷B Ⅱ以及麦冬中的麦冬皂苷D作为含量测定指标成分，对叶氏消渴方降糖颗粒剂开展质量控制技术研究。结合文献方法[23-25]，优化了流动相的比例，以乙腈-水(体积比25∶75)为最佳。皂苷类化合物紫外(200～400 nm)光区域吸收较弱，因此本文选择皂苷类成分常用的ELSD检测器进行含量测定。

4 结论

本文建立了叶氏消渴方降糖颗粒剂中梓醇、没食子酸、芍药苷、丹皮酚、知母皂苷B Ⅱ及麦冬皂苷D 6个成分的含量测定方法，该方法简便、准确、重复性好，可用于叶氏消渴方降糖颗粒剂主要活性成分含量测定，为叶氏消温饱方降糖颗粒剂的质量评价提供参考。