高效液相色谱法同时测定水产品中4种酰胺类农药残留

刘伶俐，徐飞良，黄向荣，索纹纹，万译文

(1.湖南省水产科学研究所，中国 长沙 410153；2.农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，中国 长沙 410153；3.湖南省饲料工业办公室，中国 长沙 410011；4.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，中国 常德 415000)

氯虫苯甲酰胺[1]、氟虫双酰胺[2]、唑虫酰胺[3]和氟啶虫酰胺[4]是经国家批准使用的新型、低毒、高效杀虫剂，目前已作为甲胺磷、乐果、马拉硫磷和甲基对硫磷等高毒有机磷农药的替代品[5]。酰胺类杀虫剂主要是通过作用于昆虫体内的鱼尼丁受体，促进细胞内的Ca2+失控性流失，从而高效杀死鳞翅目昆虫，这4种新型杀虫剂对于哺乳动物属于低毒，但随着产量和用量的逐年增加，很容易通过食物链富集在水生动物体内，富集倍数可达数万倍，食用受污染的水产品使农药在人体积累，达到一定程度后就会产生明显的毒害作用，包括急性毒性、慢性毒性和“三致”毒性。因农药不合理使用或不遵守安全间隔期规定导致的农药残留超标，使农药与生态环境和食品安全之间的矛盾日益显现[6]。为防止水产品农药残留严重危害消费者健康、影响水产业及水产贸易的发展，已经有许多针对农药等有毒化学品的国际公约、法规及限量标准[7-11]，对保护环境、合理使用农药、控制水产品农药残留起到了积极作用，而我国尚未对水产品残留量做限定要求。

目前，关于氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺残留量的检测分析主要是对单个物质原药、制剂或复配剂等方面的研究，且针对前两种物质的报道比较多，后两种的甚少；其研究主要集中在果蔬[12-14]、植物源食品[15-17]、药材[18]、土壤[19-21]等农产品与环境样品。现在4种物质的残留检测可采用ELISA快速检测法[22]、液相色谱法[23]、液相色谱-质谱法[2-4，14]、气相色谱法[24]、气相色谱-质谱法[25]等。ELISA快速检测法操作简便，不需要大型仪器设备，对前处理的要求低，但该方法只能用于定性和半定量检测，准确性与可靠性还需借助色谱法进行确证。液质法虽样品用量少、灵敏度高，但因其价格昂贵、运行成本相比液相色谱高，操作要求相对也高，基层检测单位难以配备和使用。气相色谱或气相色谱-质谱法仅对唑虫酰胺的残留检测具有较高的精确度和灵敏度。液相色谱仪普及范围广，其精确度、重复性等也可满足药物的多残留检测要求。目前尚未见关于高效液相色谱法对上述4种农药残留同时进行分析的相关报道。基于以上，本研究采用HPLC法，试图建立同时测定水产品中氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺残留量的检测分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，配紫外检测器(UV)；KQ-1000DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Hitachi CR22GⅢ 高速冷冻离心机(日本，Hitachi 公司)；Buchi V-300 平行蒸发仪(瑞士，Buchi公司)；N-EVAP11250氮吹浓缩装置(美国，Organomation Associates公司)，固相萃取装置20-Port SPE Manifold(美国，Agilent公司)；碱性氧化铝萃取柱(200 mg/6 mL，美国Waters公司)。

氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺标准品(纯度≥97.0%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司)，乙酸铵(色谱纯，德国Fluke公司)，乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，无水硫酸镁(MgSO4，化学纯)，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的标准。

1.2 分析方法

1.2.1样品提取与净化 准确称取已匀质好的水产样品5.00 g(精确至0.02 g)置于50 mL离心管内，依次加入2.00 g无水硫酸镁、10 mL乙腈进行提取，加盖并涡旋混匀后超声提取8 min，6 500 r·min-1离心8 min，将上清液转移至蒸发管或离心管中，重复提取1次，上清液合并至蒸发管或离心管中，45 ℃蒸发或氮吹至近干，加入2.00 mL乙腈涡旋溶解残留物待净化。将碱性氧化铝萃取柱用4 mL乙腈活化，当溶剂液面到达柱吸附表面时，立即加入待净化溶液，并用刻度为10 mL的离心管收集洗脱液，用2 mL乙腈冲洗蒸发管，重复冲洗2次，冲洗液一并过碱性氧化铝萃取柱。洗脱液一并收集，于45 ℃蒸发至干，加入1.00 mL乙腈、1.00 mL流动相涡旋溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，供高效液相色谱测定。

1.2.2 色谱分析条件 高效液相色谱柱(4.6 mm×250 mm，Waters Atlantis T3)，检测波长为265 nm，流动相为乙腈-0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲溶液体系，等度洗脱，流速0.8 mL·min-1，进样量20 μL，柱温为35 ℃。

1.2.3 标准溶液配制及标准曲线的绘制 准确称取适量氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺标准品，用乙腈溶解稀释并定容至50 mL，配制成100 mg·L-1的标准储备液，储备液于-18 ℃保存，有效期为6个月。分别取适量标准储备液，用乙腈配制成质量浓度分别为0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg·L-1的系列标准工作液，现配现用。以标准溶液质量浓度(x)与目标峰面积(y)绘制标准曲线。

1.2.4 添加回收实验 分别在水产品空白样品中添加氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺标准溶液，添加后质量分数分别为0.1，0.5，1.0 μg·g-1；分别在水产品空白样品中添加唑虫酰胺标准溶液，添加后质量分数分别为0.2，1.0，2.0 μg·g-1。每个处理6次重复，计算平均添加回收率和相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺中氟啶虫酰胺极性较大，而其他3种的极性较弱，参考已有文献资料[15-17]，以乙腈、甲醇、0.1%甲酸化乙腈、乙酸乙酯与丙酮混合液(体积比为95∶5)作为提取剂对水产品中以上4种酰胺类物质进行提取分离试验，结果见图1。结果显示，乙腈提取的4种物质的回收率均在75%以上，其提取能力强，不易提取出水产品基质中的多余杂质，能减少提取液中的干扰成分，有利于后续的净化；甲醇提取唑虫酰胺时受基质干扰特别大，未能进行有效提取，不符合实验要求；0.1%甲酸化乙腈提取的4种物质的回收率虽在70%以上，但唑虫酰胺的目标峰因受附近杂峰的干扰，严重影响了分离效果与峰型；乙酸乙酯与丙酮混合液(体积比为95∶5)提取氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的回收率均低于50%，杂质干扰较大。从提取分离效果、峰型及回收率等方面综合考虑，本文选用广泛使用并具有沉淀蛋白作用的乙腈作为水产品的提取剂，能将目标成分与杂质有效分离，峰型尖锐，基线稳定，分离时间适中。

图1 水产品中4种提取剂的提取效果色谱图

2.2 净化方法的选择

水产品由于基质成分比较复杂，且色素及脂类物质较多，可能对色谱分离效果及仪器灵敏度造成一定程度的影响，故需对样品进行净化，以满足仪器和实验要求[26]。目前，水产品的净化多选用固相萃取的方式，该技术具有易操作、溶剂用量少等优点。本文选用氨基酸柱[27]、中性氧化铝柱[28]和碱性氧化铝柱[23]3种固相萃取柱进行净化效果的对比实验，结果见图2。结果表明，经过氨基酸柱净化后，唑虫酰胺出现回收率偏低的现象，这可能是由于唑虫酰胺中—NH官能团与氨基发生键合；用中性氧化铝柱净化后，氟虫双酰胺未能与杂质完全分离，峰型不好；碱性氧化铝柱净化结果杂质干扰较小、目标物分离效果好、峰型对称，能满足实验要求。本文最终选用碱性氧化铝柱作为固相萃取净化柱。

图2 水产品中3种固相萃取柱的净化效果色谱图

2.3 色谱条件的优化

图3 4种物质标准溶液

甲醇和乙腈是检测水产品中农药残留最常用的两种有机系流动相。笔者对比甲醇和乙腈试验后得到与文献[15，23]相同的结果，即以乙腈为流动相时分离效果较好、仪器灵敏度较高，再添加一定浓度的乙酸铵，其峰型更好。结合4种目标物的化学性质及本试验分析要求，流动相选用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲溶液体系，分别对流动相体积比90∶10，80∶20，70∶30及60∶40进行比较试验，检测标准溶液及试样的分离效果。结果表明：乙腈-0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲溶液体积比为60∶40时，4种物质分离较好，且出峰时间均在15 min内，能满足样品检测的需要，见图3。

2.4 线性曲线、相关性及检出限

在上述色谱操作条件下，将配制好的氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺标准工作液(见1.2.3)依次进行测定，计算得出其线性回归方程及相关系数；以3倍信噪比(S/N)为检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)为定量限(LOQ)，计算得出其LOD和LOQ值，结果见表1。在优化条件下，4种酰胺类的线性范围均为0.05～5.0 mg·L-1，线性相关系数均不低于0.999 9。氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺的检出限均为0.1 μg·g-1，唑虫酰胺为0.2 μg·g-1，表明该方法在测定范围内线性相关性很好。

表1 4种酰胺类杀虫剂的线性回归方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 方法准确度与精密度试验

在水产品基质中加入定量的氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺标准溶液，氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺添加到0.1～1.0 μg·g-1，唑虫酰胺添加到0.2～2.0 μg·g-1，每个添加水平做6次平行实验，按1.2所述方法处理后高效液相色谱仪分析测定，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)。由表2可知，水产品中氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺在0.1，0.5，1.0 μg·g-1时的回收率为99.5%～110.5%，RSD值为1.53%～3.93%；唑虫酰胺在0.2，1.0，2.0 μg·g-1时的回收率为93.7%～109.4%，RSD值为0.83%～3.14%，能满足实验及分析要求。

表2 方法准确度与精密度试验结果(n=6)

2.6 实际样品的测定

利用本文建立的方法，随机抽取市场中 30 批次的水产品进行分析检测，样品均未检出氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺。在室内养殖水体(提前一周注入进行曝气处理)中加入浓度为5%的4种物质的混合制剂，试验鱼来自湖南省水产原种场，将其暂养一周后选取健康、体格较为一致的40条进行正式的养殖试验，试验为期25天。养殖试验结束时用ELISA快速检测法进行筛查，其中1份样品检出氯虫苯甲酰胺，1份样品检出唑虫酰胺，将此2份阳性样品用本方法和气相色谱法进行检测分析比较，结果见表3。

表3 3种分析方法结果对比

由表3可知，ELISA快速检测法虽然操作简单、对前处理的要求低，但仅限于定性检测。因氯虫苯甲酰胺不易气化，故用气相色谱法无法检出。本法经过提取净化及色谱条件的优化后，可以同时进行4种物质的测定，且检出限低、灵敏度高，具有很好的适用性和可操作性。

3 结论

本文首次建立了同时测定水产品中氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺及唑虫酰胺残留量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。该方法线性关系良好、操作简便，并具有定量准确、重复性好、分析速度快及精密度高等特点，满足水产品中氟啶虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和唑虫酰胺残留量同时分析测定的要求。