T-SPOT.TB，TB-DNA及TB-RNA联合检测对菌阴肺结核的诊断价值

谢博文，卢春

（1.郑州大学医学院，河南 郑州 450001；2.武汉市汉阳医院，湖北 武汉 430050）

0 引言

目前，肺结核仍然是危害人类身体健康的常见慢性呼吸道传染性疾病之一，结核分枝杆菌是其主要致病菌。尽管现在医疗水平迅速发展，而我国的肺结核发病率仍处世界前几位。因此，控制其发病率关键要做到早期发现、早期诊断及早期治疗[1]。临床上除了结合肺结核的临床症状及体征外，还有常规影像学检查手段包括胸部平片、CT等，而肺结核的确诊主要依靠痰培养及涂片学检查，但因结核杆菌生长周期长，痰培养耗时长及痰涂片检出率低等缺点，使部分肺结核患者痰检阴性，造成肺结核患者的漏诊、误诊等。除了确诊肺结核的痰培养及痰涂片等实验室检查外，最近在分子生物学及免疫学方面均有新的诊疗技术[2]。在所有肺结核类型中菌阴肺结核约占一半以上，故对其作出正确诊断及治疗极为重要[3]。菌阴肺结核是指经痰涂片分枝杆菌及痰培养检测结果均为阴性的活动性肺结核，故常常容易忽略[4]。近年来，结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），结核杆菌DNA（TB-DNA）及结核杆菌RNA（TB-RNA）试验是作为诊断肺结核很好的实验室检查手段。T-SPOT.TB是在全血中通过定量检测结核特异性抗原CFP-10及ESAT-6刺激下所释放出的γ-INF的T淋巴细胞数目来用于诊断结核病[5-6]，TB-DNA则是以PCR技术用于病原体的核酸诊断，而TB-RNA的检测主要以病原体RNA 为扩增靶标的核酸恒温扩增检测（SAT）技术。本文主要行T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA试验联合检测与单用检测进行对比分析，从而探讨T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA联合检测对菌阴性肺结核的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料。选择自2018年1月至2020年1月期间我院住院或门诊期间经痰涂片或痰培养确诊为菌阴肺结核的191例患者，其中男115例，女76例，平均年龄（43.76±4.34）岁；同期选取113例非结核疾病患者作为对照组，其中男74例，女39例，平均年龄（40.45±3.15）岁；两组患者间相关情况差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.1.1 初治菌阴肺结核组：即1次痰培养检查及3次痰涂片检查均为阴性的肺结核；所有191例菌阴性肺结核病例均符合2001年中华医学会结核病分会制定的诊断标准[4]。

1.1.2 非结核疾病组：经各项检查明确排除结核类疾病的113例患者，其中上呼吸道感染67例、肺炎22例、支气管扩张5例、慢性阻塞性肺疾病9例、肺癌1例，其他疾病9例。

1.2 检测方法

1.2.1 SAT检测TB-RNA：取痰液标本于离心机离心4 min，弃去上清；后置于2 mL 0.9%Nacl洗涤弃去上清液；加入60 uL TB液再次洗涤稀释后，于300 W超声波处理15 min后，再次离心10 min；取2 uL上述清液于30uL扩增管中；置于50℃恒温仪器中保温15 min；调至40℃中再次保温5 min；然后每支反应管加10 uL SAT 酶液，混合均匀后将反应管快速转至荧光定量PCR仪中；荧光检测通道设定为FAM；40℃，50个循环，共1 min；荧光信号采集60 s一次，共40次；根据CT值判断结果。SAT试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，仪器规格为ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪；

1.2.2 PCR检测TB-DNA：取痰液标本于等体积4%NaOH，摇匀，常温静置30 min左右，取1 mL离心6 min后弃去上清液；加入DNA提取液；于100℃恒温箱中维持15 min；取2 uL置于PCR试管中；置于荧光定量PCR仪进行扩增；按试剂说明书设定PCR 仪参数；根据CT值计算TB-DNA含量；TB-DNA 试剂为英国Oxford Immunotec公司提供的晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒。荧光定量PCR仪由杭州博日科技有限公司的提供的检测系统Bioer LineGene 9620。

1.2.3 T-SPOT.TB检测方法：使用T-SPOT.TB方法（酶联免疫斑点法）检测，静脉采集4mL外周血液并进行单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分离；细胞洗涤干净后将其浓度设置为250万/mL；参照T-SPOT.TB试剂盒说明书并利用酶联斑点计数仪计数每个专用微孔板内的斑点数量；阴性斑点数为0-5个。阳性标准为：①抗原A 和抗原B 检测孔计数-阴性孔计数≥6；②阴性对照孔斑点数≥6，检测孔斑点数≥2倍阴性孔斑点数。试剂盒由深圳达科为生物技术有限公司提供。

1.3 统计学分析。利用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析；符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，方差齐的计量资料，两组间比较采用单独样本t检验，方差不齐的计量资料，两组间比较采用t′检验；灵敏度及特异度等指标比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较。菌阴肺结核组、非结核疾病组两组间年龄、性别构成体及质量构成差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组研究对象基线特征的比较

2.2 3种检测方法的敏感度及特异度。T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA试验对初治菌阴肺结核的阳性率（敏感度）分别为94.8%，49.2%，63.4%；T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA试验对非结核疾病对照组的阴性率（特异度）分别为98.2%，95.6%，93.8%；可见T-SPOT.TB检测方法对初治菌阴肺结核的敏感性及特异性均显著；详见表2。

表2 3项检测方法的敏感性及特异性

2.3 三者联合检测对菌阴肺结核的阳性检出率。含T-SPOT.TB的2联对菌阴肺结核的阳性检出率为93.7%；不含T-SPOT.TB的2联对菌阴肺结核的阳性检出率为84.1%；3联检测菌阴肺结核的阳性率为98.5%；可见含T-SPOT.TB的2联阳性检出率明显高于不含T-SPOT.TB的2联检出率（P＜0.05）；3联阳性检出率明显高于2联检出率（P＜0.01），详见表3。

表3 联合检测对菌阴肺结核组的阳性检出率

3 讨论

虽然痰培养及涂片均能有效确诊肺结核，目前临床已广泛运用，但其缺点是培养周期长，使多数患者不能立即确诊，另外非活动性结核患者处于潜伏期感染以及陈旧性肺结核的存在，这给此部分患者带来的误诊率极高[7]。然而，随着医疗的发展，一些新型检查技术不断涌现，其中作为早期诊断肺结核疾病的实验室检查技术如T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA等已在某些医院广泛运用，但三者对菌阴肺结核诊断的敏感性及特异性方面报道各存差异。

PCR技术是目前临床上较为流行的实验室检查手段，而TB-DNA作为结核分枝杆菌的遗传物质，因此可通过PCR来检测TB-DNA水平，故可以用于衡量感染的结核杆菌严重程度[8]。但由于受实验室、试剂、标本等污染因素影响，且在PCR扩增过程中判定错误等均使结果易出现假阳性[9]。目前利用SAT 技术检测TB-RNA已用于临床检测结核病[10]，通过以结核分枝杆菌RNA为扩增靶点，对产物RNA进行靶向检测，故TB-RNA技术可以用于活动性肺结核的诊断及治疗检测，但其特异性及敏感性尚待于研究.。虽然TB-DNA、TB-RNA在检测结核病中均显优势，但其特异性及敏感性均不及T-SPOT.TB显著，而本研究结果亦证实T-SPOT.TB在检测菌阴肺结核方面优于以上两种检测手段，结果亦表明含有T-SPOT.TB的二联检测手段对菌阴肺结核的检出率明显高于不含T-SPOT.TB的检出率。

T-SPOT.TB技术是2001年由Dogra[11]等提出，提取经结核分枝杆菌感染的患者外周血单个核细胞中特异性活化的T细胞，后者在受到结核杆菌特异性抗原刺激后分泌干扰素-γ而设计的T细胞试验，从而通过斑点数来推测体内是否存在对结核杆菌反应的T细胞用于结核杆菌感染进行辅助诊断[12]。本研究表明，T-SPOT.TB在菌阴肺结核检测的敏感性为94.8%，特异性为98.2%，显著优于TB-DNA和TB-RNA两种检测方法，此与浦永兰等[13]表明T-SPOT.TB在菌阴肺结核组中的敏感性及特异性分别为89.6%和91.1%相接近。本研究显示，结合TB-DNA、TB-RNA，三者联合检测菌阴肺结核的阳性率为98.5%；可见含T-SPOT.TB的2联阳性检出率明显高于不含T-SPOT.TB的2联检出率（P＜0.05）；3联阳性检出率明显高于2联检出率（P＜0.01）；另外，T-SPOT.TB检测不受是否排菌、排菌数量以及排菌类型的影响，故在临床检测中较为准确及快速，对菌阴肺结核的诊断意义重大，可以作为结核病早期快速诊断的有效手段。但其缺点在于无法区分死活菌及非结核分枝杆菌类型，这无疑降低其特异性[14]。

综上可知，T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA三种方法联合检测对菌阴肺结核的阳性检出率显著高于单独检测率。因此，在今后临床中推荐三联检测菌阴肺结核方案极大提高其检出率，使漏诊率大大降低，值得临床推广。